王鴻超，陳海琴，*，趙建新，陳永泉，張 灝，王 磊，陳 衛(wèi)

（1.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.南開大學(xué)泰達(dá)生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

四氫生物蝶呤（BH4）廣泛存在于自然界中，在高等生物中作為苯丙氨酸羥化酶、酪氨酸羥化酶、色氨酸羥化酶、一氧化氮合成酶以及烷基甘油單氧酶的必需輔助因子而存在，參與苯丙氨酸降解，血清素褪黑激素等神經(jīng)傳遞素的合成過程，具有重要的生理功能[1-2]。研究還發(fā)現(xiàn)，BH4對(duì)長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸的脫氫和氧化有影響[3-5]；BH4還可促進(jìn)不飽和脂肪酸與磷脂的結(jié)合[6]；苯丙酮尿癥患者在服用BH4后，體內(nèi)的多不飽和脂肪酸組分發(fā)生變化[7]，這表明BH4與多不飽和脂肪酸的合成和積累也有重要關(guān)系。

BH4的傳統(tǒng)來源為制藥公司的有機(jī)合成，但是成本很高，而利用微生物發(fā)酵產(chǎn)BH4可以很好的解決這個(gè)問題。高山被孢霉是重要的產(chǎn)油絲狀真菌，能夠高產(chǎn)多種多不飽和脂肪酸[8]。通過本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)其全基因組測(cè)序以及四氫生物蝶呤的代謝途徑鑒定，高山被孢霉是目前已知的唯一在分子水平上驗(yàn)證過可以從頭合成BH4的真菌[9-10]。高山被孢霉BH4的合成途徑見圖1[9]。BH4及其前體二氫蝶呤三磷酸鹽和6-丙酮酰四氫生物蝶呤的氧化產(chǎn)物生物蝶呤（Biopterin）、新蝶呤（Neopterin）、和蝶呤（Pterin）具有熒光吸收，可經(jīng)高效液相色譜分離后經(jīng)熒光檢測(cè)器檢測(cè)（圖1）[11]。

圖1 高山被孢霉的四氫生物蝶呤合成途徑Fig.1 Pathways for BH4biosynthesis in M.alpina

BH4在哺乳動(dòng)物、植物中的提取和檢測(cè)方法都已得到廣泛發(fā)展，主要通過HPLC或毛細(xì)管電泳將蝶呤混合物分離后，經(jīng)電化學(xué)法直接檢測(cè)或通過熒光法檢測(cè)氧化產(chǎn)物來實(shí)現(xiàn)[11-13]，而由于真菌一般不能自身合成BH4，在真菌中檢測(cè)BH4的報(bào)道較少。同時(shí)由于真菌細(xì)胞壁較厚，細(xì)胞組成成分復(fù)雜，在高山被孢霉體內(nèi)提取純化蝶呤化合物也存在一定的難度。本研究采用離子交換樹脂法純化真菌體內(nèi)蝶呤化合物，并運(yùn)用高效液相色譜-熒光檢測(cè)法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)運(yùn)用電噴霧質(zhì)譜對(duì)定性結(jié)果進(jìn)行確認(rèn)。建立了一套真菌體內(nèi)生物蝶呤化合物提取和檢測(cè)的完整方法，為以后利用真菌發(fā)酵產(chǎn)BH4打下了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

高山被孢霉孢子 接種于100mL肯德里克（Kendrick）培養(yǎng)基[14]，25℃培養(yǎng)5d，過濾收集菌絲體，濾紙拍干樣品，存于-80℃?zhèn)溆茫坏蕵?biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：2236-60-4，純度95%）、新蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：2009-64-5，純度97.5%）、生物蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品（CAS號(hào)：22150-76-1，純度97%）標(biāo)準(zhǔn)品、Dowex?50WX8離子交換樹脂 美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈 色譜純；其他試劑均為分析純。

LC-20AT高效液相色譜儀、RF-20A熒光檢測(cè)器、色譜工作站 日本島津；熱電Finnigan LCQ Advantage電噴霧質(zhì)譜儀 美國(guó)；Eppendorf 5810R離心機(jī) 德國(guó)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品分別置于3個(gè)10mL的棕色容量瓶中，蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤分別加數(shù)滴1mol/L NaOH溶液溶解，用超純水稀釋至刻度，搖勻，配成濃度分別為蝶呤76μg/mL、新蝶呤50μg/mL、生物蝶呤50μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于冰箱內(nèi)-80℃保存，保存期限為1個(gè)月。

1.2.2 高山被孢霉體內(nèi)蝶呤化合物的提取 方法一：精確稱取菌體樣本0.5g，加入液氮研缽中充分研磨3次，加入500μL 2mol/L三氯乙酸，-20℃過夜。10000×g，30min離心去沉淀。稱取1.2g離子交換樹脂加入純化柱，用超純水清洗3次，1mol/L HCl清洗3次。將離心樣品的上清液加入純化柱中，用10mL超純水洗滌后，再加入2mL 1mol/L醋酸銨甲醇溶液洗滌，接著加入7mL 1mol/L醋酸銨甲醇溶液洗脫并收集洗脫液。最后將洗脫液凍干后用甲醇復(fù)溶，即為所得樣品。

方法二：精確稱取菌體樣本0.5g，加入液氮研缽中充分研磨3次。加入1mL 1mol/L HCl混勻，加入5mg二氧化錳搖勻，置于暗處避光氧化1h，然后加入100uL 3%維生素C溶液，接著加入500μL 2mol/L三氯乙酸，-20℃過夜，10000×g，30min離心去沉淀。稱取1.2g離子交換樹脂加入純化柱，用超純水清洗3次，1mol/L HCl清洗3次。將離心樣品的上清加入純化柱，用10mL超純水洗滌后，再加入2mL 1mol/L醋酸銨甲醇溶液洗滌，接著加入7mL 1mol/L醋酸銨甲醇溶液洗脫并收集洗脫液。最后將洗脫液凍干后用甲醇復(fù)溶，即為所得樣品。

方法三：精確稱取菌體樣本0.5g，加入液氮研缽中充分研磨3次。加入1mL 1mol/L HCl混勻，加入100μL碘-碘化鉀溶液（含1%碘化鉀和2%碘），置于暗處避光氧化1h，然后加入100μL 3%維生素C溶液，接著加入500μL 2mol/L三氯乙酸，-20℃過夜，10000×g，30min離心去沉淀。稱取1.2g離子交換樹脂加入純化柱，用超純水清洗3次，1mol/L HCL清洗3次。將離心樣品的上清液加入純化柱，用10mL超純水洗滌后，再加入2mL 1mol/L醋酸銨甲醇溶液洗滌，接著加入7mL 1mol/L醋酸銨甲醇溶液洗脫并收集洗脫液。最后將洗脫液凍干后用甲醇復(fù)溶，即為所得樣品。

1.2.3 高效液相色譜分析條件 采用Inertsil ODS-3 C18色譜柱（5μm，150mm×4.6mm；GL Science），熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)為350nm，吸收波長(zhǎng)設(shè)為450nm。分別采用甲醇-水、乙腈-水、磷酸氫二鈉緩沖溶液作流動(dòng)相來嘗試分離蝶呤類化合物。

1.2.4 電噴霧質(zhì)譜條件 電噴霧電壓為4.5kV，離子源溫度為250℃，檢測(cè)蝶呤和新蝶呤時(shí)采用負(fù)離子電離模式，檢測(cè)生物蝶呤時(shí)采用正離子電離模式，掃描范圍為100～300m/z，鞘氣和輔助氣為氮?dú)狻?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

考察了不同流動(dòng)相配比及流速對(duì)三種蝶呤類化合物色譜分離行為的影響。結(jié)果表明，乙腈-水體系作流動(dòng)相時(shí)，各種蝶呤的熒光響應(yīng)強(qiáng)度較低，且三種蝶呤類化合物的保留時(shí)間過短，同時(shí)其他共存物質(zhì)對(duì)其檢測(cè)干擾較大。而當(dāng)使用甲醇-水作為流動(dòng)相時(shí)，各物質(zhì)分離效果較好，熒光響應(yīng)強(qiáng)度較好。當(dāng)使用10mmol/L磷酸二氫鈉（pH6.0）作為流動(dòng)相，流速設(shè)為1.2mL/min時(shí)，與采用10%甲醇作為流動(dòng)相時(shí)相比，熒光響應(yīng)強(qiáng)度更強(qiáng)。同時(shí)，各物質(zhì)分離效果良好，保留時(shí)間適中，檢測(cè)時(shí)間較短，且檢測(cè)不受其他共存物質(zhì)的影響。因此采用10mmol/L磷酸二氫鈉（pH6.0）作為流動(dòng)相，蝶呤、新蝶呤、生物蝶呤的標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖2。為分步收集樣品進(jìn)行電噴霧質(zhì)譜分析，HPLC的流動(dòng)相設(shè)為10%、甲醇，流速為1mL/min[15]。

圖2 新蝶呤（A），蝶呤（B），和生物蝶呤（C）標(biāo)準(zhǔn)品圖及高山被孢霉體內(nèi)蝶呤化合物成分圖（D）Fig.2 HPLC chromatograms of neopterin standard（A），pterin standard（B），biopterin standard（C），and the pteridines in M.alpina（D）

2.2 蝶呤標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別配制一系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按選定的色譜分離條件進(jìn)行分析，并以峰面積對(duì)濃度作圖。結(jié)果表明：新蝶呤、蝶呤和生物蝶呤在0.005～1.5、0.005～2、0.01～2.0μg/mL的濃度范圍內(nèi)與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程分別為：y=615.66x+0.29（r=0.9991）；y=481.07x-2.58（r=0.9977）；y=46.5x-2.83（r=0.9963），本方法的檢出限依次是：0.003、0.002、0.005μg/mL。

2.3 不同樣品處理方法的選擇

為保證分析結(jié)果有效準(zhǔn)確，考察了3種前處理方法對(duì)檢測(cè)真菌中蝶呤類化合物的影響效果。當(dāng)采用方法一對(duì)樣品進(jìn)行處理時(shí)，由于未加氧化劑，高山被孢霉體內(nèi)的BH4及其前體6-丙酮酰四氫生物蝶呤，二氫蝶呤三磷酸鹽沒有被氧化成相應(yīng)的氧化產(chǎn)物，因此熒光響應(yīng)強(qiáng)度很低。方法二與方法三中，由于氧化劑的加入，使得四氫生物蝶呤及其前體都能被氧化成相應(yīng)的氧化產(chǎn)物生物蝶呤，蝶呤和新蝶呤，熒光響應(yīng)強(qiáng)度都很高，但是方法二中的二氧化錳氧化劑雖然能充分氧化四氫生物蝶呤及其前體，但樣品檢測(cè)時(shí)雜峰較多，干擾了各蝶呤化合物的檢測(cè)，而方法三中這兩個(gè)問題均得以解決，因此是目前從真菌高山被孢霉中提取蝶呤類化合物的最佳方法，高山被孢霉中蝶呤類化合物的檢測(cè)結(jié)果見圖2。液氮破壁也是本實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵步驟，充分的研磨能夠保證真菌樣品的破壁充分，同時(shí)合適的純化條件也很重要，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)可通過選用不同離子交換樹脂來優(yōu)化純化條件。

2.4 高山被孢霉中的蝶呤組分分析及方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 按照上述方法提取純化的樣品，經(jīng)高效液相色譜-熒光檢測(cè)法分析并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，發(fā)現(xiàn)保留時(shí)間為3、11.5、12.5min的組分分別為新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤。樣品中各組分的濃度由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見表1。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜5%，表明本方法有良好的精密度。

表1 高山被孢霉體內(nèi)的蝶呤化合物含量及加標(biāo)回收率Table 1 The amounts and recoveries of pterines in M.alpina

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取一批3份上述條件下培養(yǎng)的樣品，分別進(jìn)行樣品處理，測(cè)定其中新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤的含量，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.15%，表明本方法有較好的重復(fù)性。

2.4.3 回收率實(shí)驗(yàn) 對(duì)上述樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，分別添加三個(gè)不同水平的蝶呤、新蝶呤和生物蝶呤的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平均測(cè)定3次，結(jié)果見表1。三種蝶呤類化合物的平均回收率均在96%～98%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）小于5%，表明本方法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.5 高山被孢霉蝶呤樣品的電噴霧質(zhì)譜分析

為進(jìn)一步確定高山被孢霉中的各氧化產(chǎn)物的組成，經(jīng)過高效液相色譜分離的各組分經(jīng)分布收集后，對(duì)其進(jìn)行了電噴霧質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖3。負(fù)離子電離模式下，保留時(shí)間為3min的峰測(cè)得m/z值為252.62（圖3A），與新蝶呤的相對(duì)分子質(zhì)量253.22相符合，保留時(shí)間為11.5min的峰測(cè)得m/z值為162.88（圖3B），與蝶呤的相對(duì)分子質(zhì)量163.14相符合。正離子電離模式下，保留時(shí)間為12.5min的峰m/z值為238.87（圖3C），與生物蝶呤的相對(duì)分子質(zhì)量237.22相符合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明了高效液相色譜分離的各組分的化合物成分。

圖3 高山被孢霉體內(nèi)新蝶呤（A），蝶呤（B）和生物蝶呤（C）的電噴霧質(zhì)譜圖Fig.3 ESI MS spectra of neopterin（A），pterin（B），biopterin（C）in M.alpina

3 結(jié)論

本文系統(tǒng)地探討了產(chǎn)油絲狀真菌中二氫蝶呤三磷酸鹽，6-丙酮酰四氫生物蝶呤和BH4的檢測(cè)方法。研究了高山被孢霉中蝶呤化合物的提取方法，并建立了利用高效液相色譜法-熒光法檢測(cè)高山被孢霉體內(nèi)新蝶呤、蝶呤、生物蝶呤的新方法。此方法快速、準(zhǔn)確，能滿足實(shí)際樣品分析要求，為進(jìn)一步利用高山被孢霉產(chǎn)四氫生物蝶呤奠定了基礎(chǔ)。

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