劉穎 鄭立運 崔立然

秦艽在臨床上用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)寒引起的周身疼痛等，通常具有良好的效果[1]。高尿酸血癥是嘌呤代謝紊亂引起的尿酸生成過多和（或）尿酸排泄減少的一組代謝性疾病。據(jù)統(tǒng)計，高尿酸血癥在人群中的發(fā)病率男性高達(dá)25.8%，女性為15%[2]，其不僅可以引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，而且是心血管疾病和腎臟疾病進(jìn)展的獨立危險因素[3-6]，因此，維持穩(wěn)定的血尿酸水平對人類的健康有著重要的意義。目前，臨床上治療痛風(fēng)的藥物主要有抑制尿酸生成的別嘌呤醇和促尿酸排泄的丙磺舒、苯溴馬隆等，由于這些藥物副作用大，使其應(yīng)用受到限制。因此，借助中醫(yī)理論開發(fā)一種藥效穩(wěn)定、副作用小的天然藥物來解決這一難題具有一定的研究價值。傳統(tǒng)中醫(yī)將痛風(fēng)列入痹癥的范疇，秦艽屬于龍膽科多年生草本植物，其用藥部位為根，現(xiàn)代藥理證明其具有非常好的降尿酸效果。

目前，降低血尿酸主要通過抑制尿酸生成和促進(jìn)尿酸排泄這兩個途徑來實現(xiàn)的，腎臟是排泄尿酸的主要器官，其中OAT1、OAT3、URAT1這三種轉(zhuǎn)運蛋白在調(diào)控尿酸水平方面有著重要的意義。本研究就其是否能夠促進(jìn)尿酸排泄為切入點，使用免疫組化和Western blotting方法，通過檢測以上三種蛋白表達(dá)水平來探討秦艽降血尿酸的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 Wistar大鼠[7]，雄性，體重180～220 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：scxk（京2007-0001）。

1.2 實驗試劑 腺嘌呤（美國Sigma公司）、尿酸試劑盒（南京建成生物科技有限公司）、苯溴馬龍（宜昌長江藥業(yè)有限公

司）、DAB試劑盒（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司），蘇木素、兔源抗OAT1多克隆抗體、兔源抗OAT3多克隆抗體、兔源抗URAT1多克隆抗體和HRP-羊抗兔IgG都購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，脫脂奶粉購自博士德生物工程有限公司。

1.3 實驗器材 切片機（德國萊卡）、YDS-47-127液氮生物容器（成都全鳳液氮容器有限公司），染色缸、孵育盒、硝酸纖維素膜（NC膜）購自Amersham公司，轉(zhuǎn)膜濾紙購自Whatman公司。

1.4 方法

1.4.1 藥液配制 苯溴馬龍：根據(jù)大鼠與成人藥物劑量換算公式，成人（假設(shè)體重為70 kg）每日服用100 mg的劑量相當(dāng)于大鼠每日服用9.0 mg/kg量。將藥片壓碎，加滅菌熱蒸餾水溶解、混勻，配成9.0 mg/ml濃度的混懸液。（1）腺嘌呤：用滅菌熱蒸餾水配成溶液，按照100 mg/（kg·d）的劑量灌胃。（2）乙胺丁醇：用滅菌熱蒸餾水配成溶液，按照250 mg/（kg·d）的劑量灌胃。（3）秦艽提取物：取秦艽藥材，加50%乙醇回流提取三次，每次1.5 h，合并濾液，濃縮至藥物濃度為1 g/ml。

1.4.2 對大鼠血尿酸的影響 取Wistar大鼠40只，隨機分為四組：空白組、模型組、給藥組，陽性組，每組10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，空白組ig.生理鹽水，模型組大鼠ig/d.給予腺嘌呤和乙胺丁醇，給藥組大鼠ig/d.給予腺嘌呤和乙胺丁醇后灌胃秦艽提取物，陽性對照組大鼠每日ig.給予腺嘌呤和乙胺丁醇后灌以苯溴馬龍，于實驗第7天，灌胃1 h后，各組動物摘眼球取血，血液經(jīng)4000 r/min離心25 min，取上清液，測定血清尿酸值。

1.4.3 對大鼠24 h總尿量和尿酸排泄量影響 大鼠分組及給藥同上，于末次給藥1 h后，采用代謝籠收集大鼠24 h內(nèi)尿液，采用全自動生化分析儀檢測尿酸濃度，計算24 h尿酸總排泄量。

1.4.4 免疫組化 取Wistar大鼠15只，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機分為三組，空白組、給藥組及模型組，給藥方法同上，于末次給藥后1 h，將大鼠麻醉，取腎臟，保存在4%甲醛固定液中24 h。采用免疫組化方法，按照相應(yīng)抗體說明書檢測腎臟組織的尿酸轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白OAT1、OAT3和URAT1的表達(dá)，觀察秦艽對尿酸轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的影響。

1.4.5 Western blotting取Wistar大鼠15只，分組及給藥方法同上，末次給藥1 h后，大鼠麻醉，取其右腎，縱向切開分為兩部分，迅速置于液氮中，冷凍后，保存于-70 ℃低溫冰箱中。取200 μg組織經(jīng)研磨粉碎，加入1000 μl新鮮配制、冷蛋白裂解液。裂解液經(jīng)4 ℃、14000 r/min離心10 min，取上清液并測定蛋白濃度。取40 μg蛋白與上樣緩沖液混合，煮沸5 min，置于SDS，電轉(zhuǎn)移到NC膜，用1%脫脂奶粉封閉。用稀釋度1：1000相應(yīng)的多克隆抗體于4 ℃過夜，加入相應(yīng)的二抗室溫下溫育60 min。抗體檢查按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，計量資料以（±s）表示，比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 秦艽對大鼠血尿酸、24 h尿量及尿酸排泄量的影響 灌胃腺嘌呤和乙胺丁醇成功復(fù)制了大鼠高尿酸血癥模型，秦艽能夠降低高尿酸血癥大鼠的血尿酸，增加大鼠24 h尿量和尿酸的排泄量。見表1。

表1 大鼠24 h尿量及尿酸排泄量

2.2 秦艽對大鼠轉(zhuǎn)運蛋白的影響

2.2.1 免疫組化圖像分析與處理 免疫組化切片在光學(xué)顯微鏡下觀察，對URAT1、OAT1和OAT3在腎組織表達(dá)量的分析采用以下方法：在400倍視野下每張切片隨機選取互不重疊的10個視野，用Image-proPlusversion 6.0圖像分析系統(tǒng)（美國MdeiaCybemeties公司）進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組OATI和OAT3的蛋白表達(dá)明顯低于空白組，秦艽給藥組的OATI和OAT3的蛋白表達(dá)明顯高于模型組，模型組的URAT1蛋白表達(dá)明顯高于空白組，秦艽給藥組的URAT1的蛋白表達(dá)明顯低于模型組。

2.2.2 Western-blotting檢測結(jié)果 用目的蛋白灰度值除以內(nèi)參蛋白的灰度值所得數(shù)據(jù)，免疫組化和Western blotting實驗結(jié)果表明，秦艽能夠上調(diào)高尿酸血癥大鼠OAT1 和OAT3蛋白的表達(dá)，降低高尿酸血癥大鼠URAT1的蛋白表達(dá)。見表2。

表2 OAT1、OAT3和URAT1蛋白表達(dá)灰度分析

3 討論

模型的復(fù)制方法、陽性藥的選擇要基于實驗?zāi)康亩?，本實驗的目的是為了探討秦艽是否通過促進(jìn)尿酸排泄而達(dá)到降尿酸的作用，由于乙胺丁醇能抑制尿酸的排泄產(chǎn)生高尿酸血癥，因此，本實驗所采用的模型復(fù)制方法為傳統(tǒng)的腺嘌呤加乙胺丁醇灌胃法，選擇能夠促進(jìn)尿酸排泄的苯溴馬龍作為本實驗的陽性藥。

近年來，已從分子水平證實4種蛋白質(zhì)參與了尿酸鹽在腎小管的轉(zhuǎn)運，其中OATI和OAT3表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞基底側(cè)膜，負(fù)責(zé)將尿酸從管周毛細(xì)血管轉(zhuǎn)運到腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)，完成尿酸分泌的第一步；OAT4命名為人尿酸鹽陰離子交換器（URAT1），URATI表達(dá)在腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣，負(fù)責(zé)尿酸的重吸收[8]。這些轉(zhuǎn)運蛋白對尿酸濃度的調(diào)控作用，使其成為高尿酸血癥藥物治療的重要靶點，本實驗通過免疫組化和Western blotting方法發(fā)現(xiàn)，秦艽的有效部位能夠上調(diào)高尿酸血癥大鼠OAT1和OAT3蛋白的表達(dá)，降低高尿酸血癥大鼠URAT1的蛋白表達(dá)。這些可能是其發(fā)揮抗高尿酸癥的作用的重要機制之一，這為中藥抗痛風(fēng)疾病提供了新的科研思路和方法。

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