申乃坤，王青艷，秦 艷，朱 婧，王成華，廖思明，黃日波

(廣西科學(xué)院非糧生物質(zhì)酶解國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室國家非糧生物質(zhì)能源工程技術(shù)研究中心;廣西生物煉制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧530007)

木薯、甘蔗等作為非糧作物因糖類含量豐富，成為可用于燃料乙醇生產(chǎn)的候選原料［1］。但是以木薯粉原料進(jìn)行濃醪發(fā)酵時(shí)，存在固形物濃度增大，流動(dòng)性差的缺點(diǎn)，容易發(fā)生沉淀，不利于大罐連續(xù)發(fā)酵，也不利于蒸餾時(shí)醪塔塔釜的再沸器間接加熱，其廢糟由于含有COD濃度太高而不好處理［2］。而糖蜜中含有5% ～12%的膠體物質(zhì)，是由果膠質(zhì)、焦糖和黑色素等組成，這是酒精發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生大量泡沫的主要原因，因而降低發(fā)酵罐的利用率;膠體物質(zhì)在酒精發(fā)酵時(shí)會(huì)吸附在酵母的表面，使酵母新陳代謝作用發(fā)生困難，特別是焦糖與黑色素對(duì)酵母的酒精發(fā)酵作用抑制較大。此外，糖蜜中還含有大量灰分和一些重金屬離子(Cu2+、Pb2+等)，都不利于糖蜜高濃度發(fā)酵［3］。

現(xiàn)有技術(shù)中用于酒精和燃料乙醇生產(chǎn)的原料，基本上都是以單一原料為主，而且生產(chǎn)燃料乙醇存在技術(shù)水平低(醪液酒精終濃度10% ～12%，V/V)，發(fā)酵效率低(85% ～88%)，能耗大，環(huán)境負(fù)荷大及經(jīng)濟(jì)性有待進(jìn)一步提高等問題。在高濃度酒精發(fā)酵技術(shù)研究上，國內(nèi)外有關(guān)的科研機(jī)構(gòu)已開展了相應(yīng)的工作，通過選育高產(chǎn)菌株及發(fā)酵條件優(yōu)化，其發(fā)酵菌株酒精發(fā)酵濃度最高可達(dá)16% ～18%(V/V)［4-7］，但其發(fā)酵時(shí)間較長，發(fā)酵效率低，同時(shí)其發(fā)酵底物大多為玉米淀粉或甘蔗汁等單一原料［8-9］。有關(guān)混合原料發(fā)酵酒精研究較少，申乃坤［10］等對(duì)木薯粉與甘蔗汁混合原料發(fā)酵酒精的工藝進(jìn)行了研究;陳勇等［11］對(duì)木薯粉甘蔗汁混合發(fā)酵申請(qǐng)了相關(guān)專利。而以木薯粉與糖蜜原料采用同步糖化(SSF)混合發(fā)酵生產(chǎn)高濃度燃料酒精的研究還未見報(bào)道。

本文采用木薯粉與糖蜜原料混合發(fā)酵燃料酒精，既提高了發(fā)酵醪液的總糖濃度，又降低了淀粉質(zhì)原料醪液的固形物濃度，改善流動(dòng)性，同時(shí)也可以減弱糖蜜中有害成分對(duì)酵母菌的毒害作用，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高了發(fā)酵醪液的酒精濃度，從而提高原料的轉(zhuǎn)化速率和利用率，降低酒精的原料成本。從而節(jié)約了蒸餾蒸汽用量，又減少單位噸酒精的排糟量，而且廢糟更容易處理，減少廢糟的處理負(fù)荷，使酒精生產(chǎn)過程更環(huán)保。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

木薯粉 本地產(chǎn)木薯干片，總糖(以葡萄糖計(jì))含量71.56%。

甘蔗糖蜜 廣西豐浩酒精有限公司提供，錘度為83.5°Bx，總糖(以葡萄糖計(jì))49.5%。

耐高溫淀粉酶及糖化酶購自諾維信公司［10］。

1.2 試驗(yàn)菌株

酵母菌種為釀酒酵母GXASY-10。

1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(YPD):葡萄糖2%，酵母粉1%，蛋白胨2%。

發(fā)酵培養(yǎng)基制備［12］:采用同步糖化發(fā)酵(SSF)，取不同濃度的木薯粉放入250 mL三角瓶中，加自來水調(diào)漿，加入適量耐高溫α-淀粉酶，在震蕩水浴鍋85℃液化40 min，降溫到32℃，冷卻調(diào)pH值，加入適量糖化酶添加量為1.21 AGU/g木薯粉，并添加0.2%尿素、0.1%K2HPO4、0.05%MgSO4，接種發(fā)酵。糖蜜原料可在不同階段加入，若在液化后加入，需要用稀硫酸調(diào)糖蜜的pH值至3.8～4.0以抑制雜菌生長。

1.4 測(cè)定方法

酒精測(cè)定:氣相色譜法［13］。

還原糖測(cè)定［14］:DNS(3，5-二硝基水楊酸)比色法。

總糖測(cè)定［15］:采用稀硫酸調(diào)節(jié) pH值至1.0，沸水浴水解1 h后，測(cè)定所含還原糖量即為總糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 木薯粉與糖蜜的比例對(duì)混合原料高濃度酒精發(fā)酵的影響

根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，將總糖濃度定為26%，木薯粉和糖蜜以不同的比例混合(W/W)調(diào)漿后，制備發(fā)酵培養(yǎng)基，并添加適量的氮源、無機(jī)鹽及糖化酶，接種(10%，V/V)發(fā)酵，發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度32℃、轉(zhuǎn)速100 r/min，發(fā)酵周期48 h，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定醪液的殘?zhí)呛途凭珴舛?。每個(gè)條件設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果取平均值，以下同。

圖1 混合原料比例對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig 1 Effect of the mixing ratio on ethanol fermentation

從圖1可以看出，木薯粉與糖蜜的比例直接決定著發(fā)酵醪液的粘度和有害物質(zhì)(焦糖、黑色素、重金屬離子等)的濃度，當(dāng)木薯粉與糖蜜比例大于2：1時(shí)，發(fā)酵醪的木薯粉濃度過高，導(dǎo)致醪液的粘度及滲透壓過大，酵母菌生長和發(fā)育受到抑制，同時(shí)發(fā)酵過程中放出的二氧化碳逃逸受到抑制，從而減緩發(fā)酵速度，發(fā)酵速度延長，影響原料和發(fā)酵設(shè)備的利用率;當(dāng)木薯粉與糖蜜比例小于2：1時(shí)，發(fā)酵醪的糖蜜濃度過高，糖蜜中的有害物質(zhì)會(huì)影響酵母菌生長和代謝［13］，從而降低酒精生產(chǎn)。因此，木薯粉與糖蜜濃度的合適比例為2：1，此時(shí)酒精濃度最高為13.58%(V/V)。

2.2 糖蜜添加時(shí)間對(duì)混合原料高濃度酒精發(fā)酵的影響

糖蜜添加時(shí)間主要體現(xiàn)在發(fā)酵醪液糖濃度變化，若糖蜜添加過早，醪液的糖濃度過高，抑制酵母菌的生長發(fā)酵;若添加過晚，酵母菌的活力下降，糖代謝速度減緩，影響糖的利用。為了考察糖蜜添加時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響，分別在0、6、12、18、24 h 添加糖蜜，發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定醪液的殘?zhí)呛途凭珴舛?，結(jié)果見圖2。

圖2 糖蜜添加時(shí)間對(duì)酒精發(fā)酵的影響Fig 2 Effect of the add sugarcane molasses time on ethanol fermentation

從圖2可知，在0 h、6 h添加糖蜜時(shí)，酵母菌還處于延滯期，耗糖速度較慢，而培養(yǎng)基中木薯粉在糖化酶作用下不斷釋放出葡萄糖，使發(fā)酵醪液中糖濃度過高，影響酵母菌生長和發(fā)酵，發(fā)酵時(shí)間延長;而18 h、24 h添加糖蜜時(shí)，隨著發(fā)酵進(jìn)行，醪液酒精濃度升高，酵母菌活力下降，耗糖速度變慢，進(jìn)而殘?zhí)瞧摺⒕贫认陆?。因此，糖蜜在發(fā)酵12 h時(shí)添加為宜。

2.3 混合原料高濃度酒精發(fā)酵的重要影響因素篩選

影響混合原料酒精發(fā)酵的因素很多，除了總糖濃度和糖蜜添加時(shí)間外，還包括發(fā)酵初始pH值、氮源、無機(jī)鹽、接種量、發(fā)酵條件等，用常規(guī)方法很難快速找出影響發(fā)酵的主要因素。而P-B(Plackett-Burman)試驗(yàn)可以從眾多的考察因素中高效篩選出最為重要的因素［16］，所以本實(shí)驗(yàn)采用此方法進(jìn)行重要因素的篩選。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)及前期研究結(jié)果［10，12］，對(duì)發(fā)酵總糖濃度，糖蜜添加時(shí)間、初始pH值等9個(gè)因素進(jìn)行考察，以醪液酒精體積濃度(%，V/V)的平均值Y為響應(yīng)值，每個(gè)因素取2個(gè)水平，試驗(yàn)選用實(shí)驗(yàn)次數(shù)N-11的設(shè)計(jì)，并余留2個(gè)空白項(xiàng)估計(jì)實(shí)驗(yàn)誤差。P-B實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表1，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析采用Design-expert7.1.6軟件，從t檢驗(yàn)結(jié)果可知，有3個(gè)因素影響的可信度大于90%，分別是發(fā)酵總糖濃度X2＞糖蜜添加時(shí)間X1＞發(fā)酵的初始pH值X5，說明這3個(gè)因素是對(duì)發(fā)酵結(jié)果影響較大。需要對(duì)這3個(gè)較重要的因素進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

2.4 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)P-B試驗(yàn)篩選對(duì)發(fā)酵有顯著影響的因素及水平，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，找到進(jìn)一步響應(yīng)面優(yōu)化的中心點(diǎn)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表1 P-B試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值Table 1 P-B experiment design and its response

表2 各因素及水平對(duì)P-B實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響Table 2 The effect of factors，levels on results of P-B experiment design

表3 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The result of steepest ascent experimental

由試驗(yàn)結(jié)果可知，酒精濃度最高出現(xiàn)在第3次附近，酒精濃度為15.59%(V/V)，說明最陡爬坡試驗(yàn)的最優(yōu)點(diǎn)在試驗(yàn)3附近，故以此點(diǎn)為響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平的中心點(diǎn)。

2.5 響應(yīng)面(RSM)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

響應(yīng)面法是通過近似構(gòu)造一個(gè)具有明確表達(dá)形式的多項(xiàng)式來表達(dá)隱式功能函數(shù)。它可以對(duì)P-B試驗(yàn)篩選出的關(guān)鍵因子和最陡爬坡設(shè)計(jì)確定的濃度進(jìn)一步優(yōu)化，已獲得滿足發(fā)酵目的最優(yōu)培養(yǎng)基。響應(yīng)面設(shè)計(jì)采用Box-Behnken［17］法，以P-B試驗(yàn)確定重要因素及最陡爬坡試驗(yàn)得到的中心點(diǎn)各取3水平進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表4所示。根據(jù)Design-expert7.1.6試驗(yàn)軟件設(shè)計(jì)了3因素3水平共15個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面分析(表5)。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 4 Factors and levers of Box-Behnken experiment

表5 Box-Bohnkon試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 Experimental design of Box-Bohnkon and corresponding results

以酒精產(chǎn)率Y值為響應(yīng)值，對(duì)表5結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析，試驗(yàn)因子對(duì)Y的影響可得到方程:

回歸方程的方差分析表明，交互項(xiàng)的影響不明顯，試驗(yàn)因子與響應(yīng)值之間不是線性關(guān)系，而一次項(xiàng)和二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響是十分顯著的。對(duì)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析(見表6)。

表6 Box-Bohnkon試驗(yàn)方差分析Table 6 Analysis of variance of Box-Bohnkon experiment

一般認(rèn)為相關(guān)系數(shù)R2大于0.9，表明預(yù)測(cè)值能與試驗(yàn)值具有高度相關(guān)度［18］，而本試驗(yàn)中R2=0.9587，說明方程的擬合度很好，真實(shí)試驗(yàn)點(diǎn)結(jié)果可以用該回歸方程進(jìn)行分析，僅有不到5%的產(chǎn)量變化不能利用該模型解釋?！癕odel Prob＞F”等于0.0058遠(yuǎn)小于0.05，說明模型是重要的。圖形更能形象的反應(yīng)響應(yīng)值受各個(gè)影響因素的變化，通過得到的多元回歸方程做響應(yīng)曲面圖(見圖3～5)。

由圖3～5可知，X1，X2，X3存在極值點(diǎn)，Y 的最大估計(jì)值為16.03，此點(diǎn)3個(gè)影響因子的代碼是 X1=0.57、X2=0.25、X3=0.41，即總糖濃度為 29.14%，糖蜜的添加時(shí)間為16.5 h，發(fā)酵初始pH值為4.7，此點(diǎn)醪液預(yù)測(cè)的酒精濃度最高為16.03%。

2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為檢驗(yàn)此模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，在篩選出最優(yōu)條件下對(duì)最佳點(diǎn)進(jìn)行3次1 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)，發(fā)酵過程酒精濃度及殘還原糖變化見圖6(結(jié)果取平均值)。發(fā)酵結(jié)果平均值為16.07%。表明驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)值非常接近，說明該模型比較真實(shí)地反映各篩選因素對(duì)混合原料酒精發(fā)酵的影響。

圖6 1 L發(fā)酵罐發(fā)酵結(jié)果Fig 6 The fermentation result of 1 L fermentor

3 結(jié)論

本文先采用P-B試驗(yàn)篩選出影響木薯粉與甘蔗糖蜜原料混合發(fā)酵的主要影響因素，然后利用最陡爬坡試驗(yàn)初步確定各因素的最優(yōu)點(diǎn)作為響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，最后利用Box-Behnken設(shè)計(jì)確定篩選出因素的最佳水平。篩選出的最佳條件為:混合原料的總糖濃度為29.14%，糖蜜的添加時(shí)間為16.5 h，初始發(fā)酵pH值為4.7。在技術(shù)集成的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了3次1L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵成熟醪平均酒精濃度為16.07%(V/V)。這表明采用木薯粉與甘蔗糖蜜混合原料發(fā)酵酒精，既提高了發(fā)酵醪液的總糖濃度，又降低了淀粉質(zhì)原料醪液的固形物濃度，改善流動(dòng)性，同時(shí)也可以減弱糖蜜中有害成分對(duì)酵母菌的毒害作用，縮短發(fā)酵時(shí)間，提高了發(fā)酵醪液的酒精濃度，從而提高原料的轉(zhuǎn)化速率和利用率，降低酒精的原料成本。

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