姜婧怡，葛正龍

(遵義醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，貴州遵義 563099)

晶狀體內(nèi)沒有血管和神經(jīng)，所需的營養(yǎng)均來自房水，因此易于遭受各種應(yīng)激因子的損害，影響晶狀體的正常代謝，使晶狀體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生變性，不溶性蛋白質(zhì)相應(yīng)增多，透明的晶狀體就出現(xiàn)混濁成為乳白色，發(fā)生白內(nèi)障［1］。

近來的研究表明，熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)可幫助晶狀體中新合成的蛋白質(zhì)分子獲得天然構(gòu)象，保護(hù)它們免受應(yīng)激損害，阻止蛋白質(zhì)的不正確折疊或變性，或幫助變性的蛋白質(zhì)復(fù)性［2］。HSP70是一種重要的熱休克蛋白，Bagchi等通過研究證實(shí)在人眼中，HSP70等見于晶狀體上皮細(xì)胞和前皮質(zhì)纖維，在晶狀體上皮細(xì)胞中，HSP70的表達(dá)量隨年齡增大而下降，這種下降可能與老年性白內(nèi)障的發(fā)病有關(guān)［3］。如果使HSP70在晶狀體上皮細(xì)胞中定向表達(dá)，發(fā)揮其分子伴侶活性，恢復(fù)變性蛋白活性，可達(dá)到抑制白內(nèi)障的目的。使外源基因定向在靶組織表達(dá)，理想的方法就是將該組織特異表達(dá)的啟動(dòng)子與外源基因片段構(gòu)建為融合基因。

晶狀體蛋白是人類晶狀體細(xì)胞胞漿中重要的結(jié)構(gòu)蛋白，在晶狀體水溶性蛋白中約占90%，有研究表明αA－晶體蛋白僅局限在晶狀體內(nèi)表達(dá)，其它組織僅有少量被發(fā)現(xiàn)［4］，因此，可以說 αA－晶體蛋白是晶體特異性蛋白，將αA－晶體蛋白基因啟動(dòng)子與HSP70基因片段構(gòu)建為融合基因，可定向在晶狀體內(nèi)表達(dá)。

1 材料

1.1 質(zhì)粒和菌株 本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 pαACPIRES2－EGFP、pIRES2－EGFP－HSP70重組表達(dá)質(zhì)粒。菌株E.coil DH5α本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑和儀器 質(zhì)粒小量抽提試劑盒(Zomanbio)，膠回收試劑盒(Zomanbio)，DNA MARKERⅥ(Zomanbio)，AseⅠ(Fermentas)，XhoⅠ(Fermentas)，BamHⅠ(Fermentas)，T4 DNA Ligase(Zomanbio)，2 × Taq PCR MasterMix(ZOMANBIO)。PTC0200梯度 PCR儀(Bio－Rad，美國)，SYNGENE型凝膠電泳圖像分析(GeneGenius，美國)，IPR150.XX1.5普通培養(yǎng)箱(Sanyo，日本)，481型恒溫制冷搖床(Forma，美國)。

2 方法

2.1 目的基因的獲得

2.1.1 根據(jù)GeneBank提供的HSP70基因序列(NM－005345)，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，P1:5＇－ CCCTCGAGAGCAGGGAACCGGCATG － 3＇，劃 線部分為XhoⅠ酶 切 位 點(diǎn);P2:5＇－ CGGGATCCCAAACACAGGAAATTGAGAACTGAC － 3＇，劃線 部 分 為BamHⅠ酶切位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增目的基因，反應(yīng)體系為:引物 P1、P2 各 1 μL，pIRES2－EGFP －HSP70 1 μL，2×Taq MIX 12.5μL，ddH2O 9.5μL。輕彈試管混勻，離心3～5 s后置于PCR儀中，按以下程序進(jìn)行循環(huán):94℃預(yù)變性10 min，94℃變性1 min，57℃退火30 s，72℃延伸3 min，30個(gè)循環(huán)后72℃保溫10 min，4℃保存?zhèn)溆?。pIRES2－EGFP－HSP70質(zhì)粒圖譜(見圖1)。

2.1.2 擴(kuò)增產(chǎn)物的分離及回收 用瓊脂糖凝膠電泳分離HSP70基因的擴(kuò)增產(chǎn)物(1.0%瓊脂糖，120 V，30 min)，并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收1 900 bp左右的目的片段，－20℃保存。

圖1 pIRES2－EGFP－HSP70質(zhì)粒圖譜

2.2 目的基因的重組

2.2.1 質(zhì)粒pαACP－IRES2－EGFP擴(kuò)增 將含pαACP－IRES2－EGFP質(zhì)粒的大腸桿菌 DH5α菌種接種于LB/kana瓊脂板上，37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于LB/kana細(xì)菌培養(yǎng)液中過夜振蕩培養(yǎng)。用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取pαACP－IRES2－EGFP質(zhì)粒，－20℃保存。

2.2.2 質(zhì)粒pαACP－IRES2－EGFP的限制酶切及載體片段的分離、回收 XhoⅠ、BamHⅠ限制酶切。反應(yīng)體系為:ddH2O 8μL，質(zhì)粒DNA 6μL，10×Buffer 4μL，XhoⅠ、BamHⅠ各1μL。37℃水浴4 h。取5μL酶切產(chǎn)物電泳(1.0%瓊脂糖，120 V，30 min)并用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收載體片段(含EGFP的片段)。pαACP－IRES2－EGFP質(zhì)粒圖譜(見圖2)。

圖2 pαACP－IRES2－EGFP質(zhì)粒圖譜

2.2.3 PCR產(chǎn)物連接至 pαACP－IRES2－EGFP載體 (構(gòu)建pαACP－HSP70)相關(guān)試劑于冰水混合物中融化，依次加入以下試劑:T4 DNA Ligase 1 μL，10 × Buffer 1 μL，HSP70 1 μL，pαACP － IRES2－EGFP 3μL，ddH2O 4μL。輕彈管底后離心3～5 s，置于PCR儀中16℃過夜(約16 h)。質(zhì)粒構(gòu)建視圖(見圖3)。

圖3 重組質(zhì)粒pαACP－HSP70構(gòu)建視圖

2.2.4 轉(zhuǎn)化反應(yīng)及質(zhì)粒提取10μL連接液取轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，37℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落接種于LB/Kana細(xì)菌培養(yǎng)液中過夜振蕩培養(yǎng)。用質(zhì)粒小量抽提試劑盒提取質(zhì)粒。

2.3 重組質(zhì)粒的檢測

2.3.1 PCR檢測重組質(zhì)粒中HSP70基因片段從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌液中用擴(kuò)增HSP70的引物PCR擴(kuò)增HSP70基因(反應(yīng)體系及循環(huán)條件同2.1.1)。

2.3.2 酶切檢測重組質(zhì)粒中HSP70基因片段及αACP基因片段重組質(zhì)粒DNA的酶切檢測。分別用XhoⅠ、BamH和AseⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定。

2.3.3 DNA序列分析將經(jīng)PCR及酶切檢測后正確的重組質(zhì)粒相應(yīng)菌液送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司(測序部)測序。

3 結(jié)果

3.1 目的基因的獲取 對(duì)質(zhì)粒pIRES2－EGFPHSP70的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見約1 900 bp(1924 bp)的DNA片段，與預(yù)期大小相符(見圖4)。

3.2 目的基因的檢測

3.2.1 PCR檢測重組質(zhì)粒中HSP70基因片段對(duì)質(zhì)粒pαACP－HSP70的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物行1%的瓊脂糖凝膠電泳，可見約1 900 bp(1 924 bp)的DNA片段，與預(yù)期大小相符(見圖5)。

3.2.2 酶切檢測

3.2.2.1 酶切鑒定重組質(zhì)粒中HSP70基因片段將質(zhì)粒pαACP－HSP70雙酶切(XhoⅠ、BamH Ⅰ)產(chǎn)物行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可見約5 200 bp和1 900 bp的DNA片段，其中5 200 bp片段為質(zhì)粒pαACP－IRES2－EGFP的 DNA 片段，1 900 bp片段為HSP70的DNA片段，均與預(yù)期大小相符(見圖6)。

3.2.2.2 酶切鑒定αACP基因啟動(dòng)子片段 將質(zhì)粒 pαACP－HSP70雙酶切(AseⅠ、XhoⅠ)產(chǎn)物行0.8%的瓊脂糖凝膠電泳，可見約6 600 bp和450 bp的DNA片段，其中6 600 bp片段為質(zhì)粒pαACP－IRES2－EGFP的 DNA片段，450 bp片段為 αA晶體蛋白基因啟動(dòng)子的DNA片段，均與預(yù)期大小相符(見圖7)。

3.3 DNA序列分析 測序結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)所克隆HSP70基因與基因庫中的同種序列比較均有100%的同源性，證實(shí)真核表達(dá)載體 pαACPHSP70構(gòu)建成功。測序結(jié)果比對(duì)圖和測序結(jié)果峰值圖(見圖8、圖9)。

圖9 重組質(zhì)粒pαACP－HSP70中HSP70基因的DNA測序結(jié)果峰值

4 討論

白內(nèi)障(catarat)是主要的致盲疾病之一，根據(jù)1999年流行病學(xué)調(diào)查已證明白內(nèi)障是我國第一位的致盲眼?。?］。目前為止，外科手術(shù)是白內(nèi)障最主要的治療方式［6］，但手術(shù)治療本身存在著一定的風(fēng)險(xiǎn)和危險(xiǎn)的并發(fā)癥，因此，探尋一種安全而有效的治療白內(nèi)障的方法具有現(xiàn)實(shí)意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們對(duì)疾病分子機(jī)制認(rèn)識(shí)的深入，基因治療的疾病譜范圍的擴(kuò)大［7］，通過導(dǎo)入外源基因來治療和抑制白內(nèi)障正逐漸被人們所研究。

HSP70是重要的伴侶蛋白，能與蛋白分子結(jié)合，參與蛋白質(zhì)的伸展、折疊及多聚復(fù)合體的組裝，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)受損而變性時(shí)，促使受損蛋白質(zhì)恢復(fù)，并加速其降解和清除，維護(hù)細(xì)胞的功能［8］。目前，已有通過誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性HSP70或利用外源性HSP70治療肝炎、腫瘤、耳疾病等疾病的研究報(bào)道［9－12］。隨著研究的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)白內(nèi)障與HSP70有著密切的聯(lián)系。已有研究證明，可溶性成分中的HSP70在正常晶狀體囊膜中是明顯可見的，但是隨著年齡增長，HSP70 表達(dá)量減少［13－14］。HSP70在晶體上皮細(xì)胞中的的表達(dá)量減少可導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞中變性蛋白的恢復(fù)和降解速度減慢，使晶狀體的透明性受損，反映了晶狀體細(xì)胞的自我修復(fù)功能的下降。研究表明，小分子熱休克蛋白α－晶狀體蛋白及HSP70在熱應(yīng)激晚期明顯增加［15］。以上研究均表明HSP70與白內(nèi)障關(guān)系密切，將HSP70基因定向表達(dá)于晶狀體內(nèi)，可能會(huì)起到抑制白內(nèi)障的作用。

晶狀體蛋白是人類晶狀體細(xì)胞胞漿中主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在晶狀體水溶性蛋白中約占90%，已有研究表明αA晶體蛋白僅局限于晶狀體內(nèi)表達(dá)，其它組織僅有少量被發(fā)現(xiàn)［4］，因此，可以說 αA－晶體蛋白是晶體特異性蛋白，將αA－晶體蛋白基因啟動(dòng)子與HSP70基因片段構(gòu)建為融合基因，可定向在晶狀體內(nèi)表達(dá)。

本課題組在前期實(shí)驗(yàn)中通過基因克隆的方法克隆小鼠αA晶狀體蛋白基因特異性啟動(dòng)子活性片段(αACP)，利用基因重組技術(shù)將αACP替換真核表達(dá)載體pIRES2－EGFP上的CMV啟動(dòng)子，命名融合質(zhì)粒為 pαACP－IRES2－EGFP，通過 DNA測序證實(shí)其克隆成功，并實(shí)現(xiàn)其在大鼠晶狀體上皮細(xì)胞中的特異性表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)首先運(yùn)用PCR的方法擴(kuò)增HSP70基因，通過基因重組技術(shù)與pαACP－IRES2－EGFP連接，構(gòu)建晶狀體特異性表達(dá)載體pαACP－HSP70，酶切、PCR 檢測 HSP70及啟動(dòng)子αACP基因片段，結(jié)果與預(yù)期相符;將重組質(zhì)粒送往上海生物技術(shù)有限公司測序，結(jié)果顯示所克隆的HSP70基因與基因庫中的同種序列比較，核苷酸序列有100%的同源性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:晶狀體內(nèi)特異性表達(dá)載體pαACP－HSP70構(gòu)建成功，相較于其他基因表達(dá)載體，pαACP－HSP70有如下優(yōu)點(diǎn):①含有αA－晶體蛋白基因啟動(dòng)子的活性片段即αACP，因其在晶狀體內(nèi)特異性表達(dá)，可使連接的外源基因HSP70在晶狀體內(nèi)定向表達(dá)，使基因治療白內(nèi)障更具靶向性。②含有EGFP，在外源基因HSP70下游含有報(bào)告基因EGFP，檢測外源基因的表達(dá)可以通過檢測EGFP表達(dá)的綠色熒光蛋白來完成，簡單直觀。綜上所述，成功構(gòu)建的晶狀體內(nèi)特異性表達(dá)載體pαACP－HSP70為進(jìn)一步研究HSP70基因?qū)Π變?nèi)障的治療作用奠定基礎(chǔ)。

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