郭常敏，王達利，魏在榮，龍 艷

(遵義醫(yī)學(xué)院燒傷整形外科，貴州遵義 563099)

軟組織損傷、骨折、軟骨缺損等是外科常見病多發(fā)病，損傷修復(fù)與重建、骨折、軟骨的再生與治療也是外科棘手問題，自體脂肪移植也是目前美容外科較好的方式之一。骨髓來源的間充質(zhì)干細胞(BMSC)是較早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的成體干細胞之一［1］，近年來通過對不同來源成體干細胞的研究和探索，有了進一步的發(fā)展，干細胞的應(yīng)用逐漸廣泛［2］，但仍然存在多方面的不足，如來源有限，獲取困難等，不能很好的解決、應(yīng)用于臨床問題，而脂肪間充質(zhì)干細胞來源方便，可以是肥胖病人抽脂所得，也可以是外科手術(shù)中剩余的脂肪標本，總之來源方便，獲取量多，且自體移植，避免了免疫排斥反應(yīng)。目前多數(shù)學(xué)者對其定向誘導(dǎo)分化的研究局限于前3代細胞，多次傳代后是否能保持良好的生物學(xué)特性還需要進一步明確。本文通過分離培養(yǎng) ADSCs，并對P9進行定向誘導(dǎo)分化，證明P9仍保持良好干性，在特定微環(huán)境下可以定向誘導(dǎo)分化。經(jīng)過多次傳代以后，可以提供充足的ADSCs，這就解決了干細胞來源相對不足的問題，只要少量的干細胞經(jīng)過多次傳代即可滿足臨床需求，為組織工程提供了很好的種子細胞來源。

1 材料與方法

1.1 標本來源及制備 標本來源于遵義醫(yī)學(xué)院整形外科手術(shù)病人剩余的脂肪組織，女性，28歲，無全身系統(tǒng)疾病，經(jīng)患者知情同意，留取手術(shù)中剩余脂肪組織備用。

1.2 主要的儀器和試劑 CO2培養(yǎng)箱(Thermo Forma，USA)，流 式 細 胞 儀 (FACSCalibur，BD，USA)，流式結(jié)果分析軟件CellQuest(USA)，超純水制備系統(tǒng)(MILLI－Q Biocel，MILLIPORE，USA)，倒置相差顯微鏡(Olympus，Japan)，高速低溫離心機(Centrifuge 5804R，Eppendorf，Germany)，恒溫水浴搖床 (SBD 50，Heto，Denmark)，－ 80℃ 冰 箱(JOUAN Nordic，Denmark)，正壓過濾器(Millipore，USA)，分散酶(Gibco，USA)，Ⅰ型膠原酶 (Gibco，USA)，0.125%胰蛋白酶(Gibco，USA)，L － DMEM培養(yǎng)液 (Gibco，USA)，胎牛血清 (FBS，Gibco，USA)，小鼠抗人角蛋白19單克隆即用型抗體(Anti－ CK19 antibody，Gene Tech，中國)，小鼠抗人波形蛋白單克隆即用型抗體(Anti－vimentin antibody，Gene Tech，中國)，小鼠抗人單克隆熒光標記抗體CD105－PerCP Cy5.5、CD44－PE、CD90－FITC、CD73－APC、CD34+45+11b+19+DR －PE(BD，USA)，二步法抗兔/鼠通用型免疫組化檢測試劑盒(Gene Tech，中國)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Peprotech，USA)，人間充質(zhì)干細胞成脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(Cyagen，中國)。

1.3 ADSCs分離和培養(yǎng) 嚴格無菌條件下，在超凈工作臺內(nèi)將外科手術(shù)切除新鮮脂肪組織5 g左右，用含1%雙抗(PS)的D－PBS洗滌3次，用眼科剪眼科鑷仔細剝離并棄除組織中的血管及筋膜，在培養(yǎng)皿中將脂肪肪組織剪成糊狀后移入無菌青霉素瓶，加入2倍體積的1 mg/mL的Ⅰ型膠原酶37℃條件下，消化約1 h后加入等體積完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清的L－DMEM培養(yǎng)液、1%L－谷氨酰胺、1%PS)終止消化。200目孔徑的鋼網(wǎng)過濾收集細胞濾液，1 500 rpm離心12 min，棄上清后用完全培養(yǎng)液重懸細胞，接種于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶，置于37℃，5%CO2飽和濕度條件下的孵箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h后觀察更換含5 ng/mL bFGF的培養(yǎng)基。待原代細胞融合度達90%左右時，用含1%PS的D－PBS洗滌 2次，加入 0.125%胰蛋白酶 －0.02%EDTA 37℃消化30～60 s，倒置相差顯微鏡下觀察待胞質(zhì)回縮后用完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞，1 200 rpm離心5 min，棄上清，用含bFGF的培養(yǎng)基重懸細胞，以1∶2的比例傳代，置于37℃，5%CO2，飽和濕度條件下孵箱內(nèi)培養(yǎng)，每2～3 d換液一次，細胞融合80% ～90%傳代。

1.4 觀察細胞形態(tài)，檢測增殖活力，計算倍增時間和擴增倍數(shù) 原代細胞培養(yǎng)24h后觀察其貼壁情況。取第3代生長狀態(tài)良好的貼壁細胞胰蛋白酶消化收集細胞，1 200 rpm離心6 min，完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整密度為2×104/mL接種于24孔板中，次日每天消化3孔，細胞計數(shù)，倒置相差顯微鏡下計數(shù)3次，取平均值，以后每天消化3孔計數(shù)，8 d后根據(jù)細胞增殖情況繪制細胞曲線。期間每2～3 d換液一次。根據(jù)Td=T×［lg2/lg(Nt/N0)計算細胞倍增時間，T代表生長曲線中的指數(shù)增殖時間段，N0是接種時的細胞數(shù)，Nt是指數(shù)增殖末期的細胞數(shù)。根據(jù)Nt/N0計算細胞擴增倍數(shù)。

1.5 免疫細胞化學(xué)檢測CK19、波形蛋白的表達取第3代貼壁細胞胰酶消化后，1 200 rpm離心6 min，完全培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度為2×104/mL接種于小培養(yǎng)皿中，待細胞生長到75%左右PBS沖洗，4%多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次×3 min;滴加0.3%Triton－X100濕盒內(nèi)室溫孵育20 min，PBS沖洗3次×3 min;室溫下封閉液封閉30 min;滴加一抗(小鼠抗人的單克隆抗體CK19、波形蛋白，空白對照組用PBS替代，4℃過夜。次日(16～17 h后)復(fù)溫，PBS沖洗3次 ×3 min;滴加生物素標記的二抗(兔抗鼠IgG)，37℃孵育30 min，PBS洗3次;3－二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色10 s，自來水沖洗終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染1 min，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，觀察結(jié)果并拍照。

1.6 流式細胞儀檢測細胞表面標志 取第9代貼壁細胞，消化，離心，D－PBS重懸并調(diào)整細胞密度約為2.4×106/mL;取細胞懸液100μL加入3μL/8μL不同的熒光標記單克隆抗(CD105－PerCP Cy5.5、CD44 － PE、CD90 － FITC、CD73 － APC、CD34+45+11b+19+DR－PE)和同型陰性對照小鼠單克隆抗體振蕩混勻，室溫避光孵育20 min。每管加入2 mL含1%NaN3的PBS，混勻，1 000 rpm離心5 min，棄上清，振蕩重懸細胞。每管加入200 μL含0.1%多聚甲醛的PBS溶液，混勻固定，4℃冰箱放置，待上流式細胞儀檢測。

1.7 體外定向誘導(dǎo)分化能力檢測 收集第8代細胞，參照誘導(dǎo)培養(yǎng)基說明書，制備誘導(dǎo)培養(yǎng)基和細胞懸液，按說明書參照濃度接種于6孔培養(yǎng)板中，進行如下分化誘導(dǎo)鑒定。

1.7.1 向成脂肪細胞誘導(dǎo)分化 細胞接種后每3 d換液一次，待細胞生長融合至80% ～90%，吸取完全培養(yǎng)基，每孔加入2 mL成脂分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基A(成脂分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基A 175 mL+FBS 20 mL+青鏈霉素(penicillin－streptomyc)2 mL+谷氨酰胺(Glutamine)2 mL+胰島素(Insulin)200(L+IBMX200(L+吲哚美辛(Rosiglitazone)200(L+地塞米松(Dexamethasone)200(L)誘導(dǎo)培養(yǎng)3 d后，吸出培養(yǎng)基A，加入2 mL成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基B(成脂分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基 B 175 mL+FBS 20 mL，penicillin－streptomyc 2 mL+Glutamine 2 mL+Insulin 200(L)，24 h后再換回成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基A液，如此循環(huán)5次即誘導(dǎo)完成，吸出誘導(dǎo)培養(yǎng)基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30min，油紅O染色30 min，鏡檢、拍照。

1.7.2 向成骨細胞誘導(dǎo)分化 細胞接種后每3 d換液一次，待細胞生長融合至80% ～90%，吸掉培養(yǎng)基，每孔加入2 mL成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(成骨分化誘導(dǎo)基礎(chǔ)培養(yǎng)基175 mL+FBS 20 mL+penicillinstreptomyc 2 mL+Glutamine 2 mL+抗壞血酸(A-scorbate)400(L+(－甘油磷酸鈉(Glycerophosphate)2 mL+Dexamethasone 20(L)，每3 d換一次液。常規(guī)誘導(dǎo)21 d后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，加入2 mL 4%中性甲醛固定30 min，茜素紅染色5 min，鏡檢、拍照。

1.7.3 向成軟骨細胞誘導(dǎo)分化 細胞接種后離心1 000 rpm×6 min，離心后注意保持細胞團不被打散，置于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱中，3 d換一次成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液(基礎(chǔ)培養(yǎng)基194 mL+A-scorbate 600(L+Dexamethasone 20(L+Sodium Pyruvate 200(L+Proline200(L+TGF－(32 mL+ITS supplement 2 mL+1%TGF－(3)，換液時輕彈離心管壁使細胞團塊脫壁懸浮，每次換液加誘導(dǎo)培養(yǎng)基1mL。常規(guī)誘導(dǎo)3 wk后棄培養(yǎng)基，PBS清洗2次，4%多聚甲醛固定30 min，石蠟包埋切片，脫蠟蒸餾水沖洗。阿利辛藍染色液浸染30 min，終止染色、鏡檢、拍照。

2 結(jié)果

2.1 ADSCs形態(tài)及生長特點及增殖活力、倍增時間和擴增倍數(shù) 原代細胞培養(yǎng)24 h后首次觀察，細胞形態(tài)不規(guī)則，呈梭型或多角形、排列紊亂，集落樣生長。原代細胞生長較慢，7～8 d首次傳代，傳代后細胞增殖速度明顯增加，3～4 d即生長融合至85% ～90%，連續(xù)多次傳代后，細胞形態(tài)較為均一，多以梭形為主，呈放射狀、漩渦狀排列生長。傳至8代細胞仍呈梭形，立體感好。細胞計數(shù)顯示第1～2天生長緩慢，第3～5天進入對數(shù)期，第7～8天生長緩慢，進入平臺期(見圖1)。第3代細胞倍增時間約為51.6 h，擴增倍數(shù)為2.62倍。

圖1 ADSCsP3生長曲線(細胞數(shù)×104)

2.2 CK19、波形蛋白(vimentin)的表達 免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示:該細胞不表達上皮細胞標志物CK19，間充質(zhì)細胞標志物vimentin陽性表達，對照組結(jié)果呈陰性(見圖2)。

2.3 流式細胞學(xué)檢測ADSC細胞表面標志表達流式細胞學(xué)檢測結(jié)果顯示，第9代ADSC細胞CD105、CD90、CD44、CD73 分 別 為 91.25%，96.43%，99.69%，99.86%，CD45+34+11b+19+DR為0.43%(見圖3)。

圖2 ADSCs CK19及vimentin的表達(×100倍)

2.4 體外向成脂、成骨、成軟骨細胞誘導(dǎo)分化 脂肪細胞誘導(dǎo)液加入9d后，細胞體積增大，胞質(zhì)中有小的圓形、透亮的脂滴出現(xiàn)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，脂滴逐漸增多，體積增大，由原來的梭形變?yōu)閳A形，互相融合，折光性增強。第17天見較多脂滴且環(huán)狀排列，停止誘導(dǎo)，油紅O染色見陽性(見圖4 A)。成骨誘導(dǎo)10 d左右細胞外基質(zhì)見有少量黑色組織沉積，似鈣鹽沉積，14 d左右見有圓形較明顯鈣結(jié)節(jié)形成，隨著誘導(dǎo)時間的延長，黑色鈣鹽沉積增加，待誘導(dǎo)分化21 d后進行茜素紅S染色，可見細胞外基質(zhì)的鈣鹽被染成紅色(見圖4 B)。軟骨誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)培養(yǎng)后，見細胞團塊逐漸增大，待誘導(dǎo)21 d后阿利辛藍染色呈陽性(見圖4 C)。

圖3 ADSCs流式細胞檢測

圖4 ADSCs體外誘導(dǎo)分化結(jié)果

3 討論

隨著干細胞的廣泛應(yīng)用，繼胚胎干細胞之后，骨髓間充質(zhì)干細胞、臍帶血來源的間充質(zhì)干細胞等成體干細胞已成為組織工程學(xué)、創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)、再生醫(yī)學(xué)、遺傳醫(yī)學(xué)等多種學(xué)科的研究熱點。自 Zuk等［3］2001年提出ADSC的的概念以來，脂肪間充質(zhì)干細胞因其比 BMSC產(chǎn)量更多、分離更方便、來源更廣泛［4］的優(yōu)點而成為研究熱點之一。ADSCs體外定向誘導(dǎo)可以向脂肪細胞、軟骨細胞、心肌細胞、骨細胞、神經(jīng)元細胞等方向分化［5］，因此在再生醫(yī)學(xué)及組織工程學(xué)領(lǐng)域中有著重要的應(yīng)用價值。目前ADSCs的培養(yǎng)多數(shù)局限于前3代，本實驗對第9代ADSCs的生物學(xué)特性進行了初步研究，初步表明本分離、培養(yǎng)方法可能有望彌補ADSCs產(chǎn)量不足的問題，即可能只要5g左右脂肪，ADSCs即可以獲得大量增殖。原代細胞貼壁融合90%，可獲得0.8×106～1×106個細胞，經(jīng)傳至第9代，可獲得約2×108個細胞，足夠作為一名患者移植治療的細胞數(shù)量。

本實驗通過機械分離聯(lián)合酶消化法分離、提取ADSCs。經(jīng)過體外培養(yǎng)、傳代純化，取第3代貼壁細胞檢測表皮細胞特異性標志CK19和間充質(zhì)細胞特異性蛋白波形蛋白。波形蛋白是一種間充質(zhì)來源的所有細胞骨架成份和特異性標志。本實驗分離的細胞陽性表達波形蛋白，陰性表達CK19，可以證明實驗所用細胞確實來源于間質(zhì)。

間充質(zhì)干細胞(MSC)因特異性陽性表達而不表達或低表達造血干細胞表面標志物CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、CD19 或 HLA － DR［6］，本實驗依據(jù)該標準對第9代ADSC進行了檢測，結(jié)果高表達 CD105、CD73、CD90，不表達(或低表達)CD34、CD45、11b、CD19、HLA － DR，符合 2006 年國際細胞治療協(xié)會(ISCT)MSC檢測指標CD45的表達率＜2%［7］相吻合，即滿足間質(zhì)干細胞特異性表面分子的要求，排除了造血干細胞來源的可能。

本實驗對P9 ADSCs進行定向分化誘導(dǎo)，向成脂方向誘導(dǎo)21 d后油紅O染色陽性;向成骨方向誘導(dǎo)21 d后茜素紅S染色，可見細胞外基質(zhì)的鈣鹽被染成紅色;向成軟骨方向誘導(dǎo)21 d后進行固定、包埋、切片、脫蠟，阿利新蘭特異性染成藍色，說明ADSCs經(jīng)誘導(dǎo)分化為成脂、成骨和成軟骨細胞?？梢奝9 ADSCs仍然具有多向分化的能力，保持良好的干細胞多向分化潛能。且純度高，性質(zhì)穩(wěn)定，則可由少量細胞經(jīng)傳代擴增，獲取足夠數(shù)量的種子細胞，解決了干細胞來源相對不足的問題，為組織工程、修復(fù)重建科學(xué)及其他醫(yī)學(xué)學(xué)科提供了良好的種子細胞。

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