張秀麗，梁單，李紅娟，馬健飛，胡曄，樊怡，王力寧

（1.中國醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，沈陽，110001；2.本溪市中心醫(yī)院腎內(nèi)科，遼寧 本溪，117000；3.中國人民解放軍95935部隊，哈爾濱，150000）

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是慢性腎臟病一體化治療的主要替代治療方法。腹膜纖維化是維持性腹膜透析患者常見的嚴重并發(fā)癥，是各種原因引起的腹膜問題的最后轉(zhuǎn)歸，是導致腹膜結(jié)構(gòu)改變和超濾功能喪失，患者退出腹膜透析的主要原因之一［1］。無論是反復發(fā)生的腹膜炎，還是非生物相容性的腹膜透析液或者腹透液在加熱處理過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，都是引起腹膜纖維化的常見原因［2，3］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革蘭陰性桿菌細胞壁的裂解成分，是該類細菌的主要致病因素之一。腹膜間皮細胞（peritoneal mesothelial cell，PMC）是腹膜發(fā)揮透析作用的主要細胞群，在調(diào)節(jié)腹膜功能，抑制炎癥和纖維化中起著關鍵作用［4］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導致PMC發(fā)生向肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)分化，是腹膜組織發(fā)生纖維化的早期和可逆階段。大量的研究表明，必需微量元素鋅是機體多種酶的必需組分或激活因子，參與多種信號通路的傳導，具有抗炎、抗纖維化、抗氧化應激的作用［5，6］。文獻證實，終末期腎臟病患者，包括已經(jīng)進行血液透析和腹膜透析的患者均存在不同程度的鋅缺乏［7，8］。以往的研究證實，鋅補充能夠抑制或減輕一些動物模型和臨床患者的纖維化。相反，鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化［9］。因此我們有理由推測鋅離子可能對PMC的EMT有一定的影響。本實驗旨在研究鋅離子對LPS誘導的RPMC的EMT的影響，從而為鋅離子在PD中的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級SD雄性大鼠，體質(zhì)量120～160 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

DMEM/F12干粉培養(yǎng)基和胎牛血清（GIBCO，美國），胰蛋白酶、兔抗大鼠α?SMA、脂多糖粉劑（Sig?ma，美國），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（杭州博日），兔抗大鼠Smad2、Smad3、P?Smad2、P?Smad3、E?cadherin，colla?genⅠ抗體（Santa?Cruz）。TGF?β1 ELISA試劑盒（R﹠D systems，美國）。

1.3 大鼠腹膜間皮細胞的原代培養(yǎng)、傳代與鑒定

選擇120～160 g雄性清潔級SD大鼠，局麻后無菌取大網(wǎng)膜，在PBS中洗去紅細胞，然后用含0.125%胰蛋白酶、0.01%EDTA的PBS液消化（37℃）20～25 min，之后棄去消化液再加入胎牛血清（FBS）終止消化，吹打收集消化下來的單個細胞，4 ℃下離心（800 r/min，5 min），得到細胞團，用DMEM/F12培養(yǎng)液（含青、鏈霉素100 U/mL及10%FBS）重懸細胞，接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。待細胞融合達80%時傳代，用PBS液洗1次后，加0.125%胰蛋白酶2 mL室溫消化3 min，用FBS終止消化，4℃離心，細胞團用DMEM/F12生長液重懸，以2×106/mL的密度接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，在CO2孵箱中培養(yǎng)24 h后首次換液，以后每2～3 d換液1次。第2代被培養(yǎng)的細胞匯合至90%時經(jīng)倒置相差顯微鏡觀察并用細胞角蛋白抗體及波形蛋白抗體行免疫組化染色鑒定，明確其為PMC，純度達到99%以上。第3代細胞用于實驗［10］。

1.4 實驗分組

第3代腹膜間皮細胞達90%融合時（細胞數(shù)約為5×106）進入實驗，用1%胎牛血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h同步化后，隨機分為下列各組：（1）正常對照組；（2）脂多糖組：100 μmol/L 作用 48 h；（3）ZnSO4組：30 μmol/L ZnSO4作 用 24 h；（4）ZnSO4/LPS組 ：30 μmol/L ZnSO4作用24 h再加100 μmol/L脂多糖作用48 h。脂多糖及ZnSO4的濃度選擇均采用MTT間接法觀察在不同時間段和不同劑量下殺傷活性的變化篩選，經(jīng)多次預實驗且參照文獻［11］。

1.5 大鼠腹膜間皮細胞增殖率測定

RPMCs接種于96孔培養(yǎng)板，每孔0.1 mL培養(yǎng)基，24 h后細胞貼壁，更換培養(yǎng)液，分別加入100 μmol/L LPS，30 μmol/L ZnSO4，30 μmol/L ZnSO4/100 μmol/L LPS復合培養(yǎng)48 h后每孔加MTT 10 μL，4 h后，吸凈培養(yǎng)液，加入 DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解，酶標儀測量490 nm波長的吸光度值（OD）。

1.6 免疫熒光

RPMCs轉(zhuǎn)至24孔板，分組處理同前，每組設4個復孔，多聚甲醛固定，0.3%Triton?X破膜，BSA室溫孵育30 min。一抗4℃孵育過夜，羊抗鼠Alexa Fluor 488標記熒光二抗室溫下孵育120 min，DAPI染核3～5 min。熒光顯微鏡下觀察α?SMA的表達。α?SMA蛋白表達的信號呈紅色熒光，DAPI呈藍色熒光。

1.7 Western印跡法

采用Western印跡法檢測α?SMA、E?cadherin 、collagenⅠ、Smad2、Smad 3、P?Smad2、P?Smad3蛋白表達。冰上裂解細胞，4℃1 000 r/min離心5 min，留取上清用Bradford法測定蛋白濃度?？偟鞍咨蠘佑?2%SDS?PAGE膠電泳分離，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含5%脫脂奶粉的TBST封閉60 min后，分別加入兔抗大鼠α?SMA、E?cadherin、collagenⅠ和Smad2、Smad 3、P?Smad2、P?Smad3抗體，小鼠抗大鼠β?actin抗體（1∶1 000，北京中杉金橋），4℃過夜，洗膜，分別加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG（1∶1 500，北京中杉金橋）、山羊抗小鼠IgG（1∶1 500，北京中杉金橋），室溫孵育2 h，洗膜，ECL發(fā)光法顯影，掃描儀成像，自動成像系統(tǒng)分析。

1.8 ELISA法檢測上清液TNF?α和TGF?β1的表達

按照TNF?α、TGF?β1 ELISA試劑盒操作說明測定大鼠腹膜間皮細胞上清液中TNF?α、TGF?β1的蛋白濃度，450 nm波長測量各孔的光密度值，TNF?α、TGF?β1含量計算結(jié)果以pg/mL表示。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 MTT測定RPMCs增殖

MTT結(jié)果顯示，LPS明顯抑制RPMCs的增殖，而ZnSO4/LPS組的RPMCs的增殖率明顯高于LPS組（圖1）。

圖1 MTT法測定細胞增殖率Fig.1 Assessment of cell viability by MTT assay

2.2 細胞免疫熒光結(jié)果

免疫熒光結(jié)果顯示，LPS培養(yǎng)48 h后細胞形態(tài)開始發(fā)生變化，由典型的上皮逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類似肌成纖維細胞，而ZnSO4/LPS組細胞形態(tài)改變明顯減輕。同時LPS組細胞的α?SMA熒光強度明顯增加。與此相比，ZnSO4/LPS組的α?SMA熒光強度明顯下降（圖2）。

圖2 α?SMA熒光顯微鏡觀察×200Fig.2 Expression of α?SMA in RPMCs ×200

2.3 鋅補充對LPS誘導的RPMCs的α?SMA 、E?cad?herin、collagenⅠ蛋白表達的影響

為了檢測鋅離子對LPS誘導的RPMCs的EMT的影響，我們采用Western blot方法檢測α?SMA、E?cadherin、collagenⅠ蛋白表達，LPS可導致α?SMA 和collagenⅠ的上調(diào)表達，鋅補充可明顯減少LPS導致的α?SMA和collagenⅠ的上調(diào)表達。同時我們發(fā)現(xiàn)，LPS可下調(diào)E?cadherin的蛋白表達，鋅補充可以明顯逆轉(zhuǎn)LPS引起的E?cadherin蛋白的下調(diào)表達（圖3）。

圖3 鋅補充對LPS誘導的RPMCs的EMT標記蛋白表達的影響Fig.3 Effects of Zn supplementation on the expression of LPS?induced EMT proteins

2.4 鋅補充對LPS誘導的TNF?α和TGF?β1產(chǎn)生的影響

與對照組相比，LPS組大鼠腹膜間皮細胞TNF?α和TGF?β1表達顯著升高，與LPS組相比，ZnSO4/LPS組TNF?α和TGF?β1表達顯著降低（圖4）。

圖4 鋅離子對LPS誘導的RPMCs的TNF?α和TGF?β1表達的影響（ELISA）Fig.4 Effect of Zn ion on the TNF?α and TGF?β1 expression in the LPS?treated RPMCs by ELISA

2.5 鋅補充對LPS誘導的TGF?β/Smad信號通路的影響

以往的文獻證實，TGF?β/Smad信號通路在多種細胞發(fā)生EMT過程中發(fā)揮重要的作用［2］。我們推測鋅離子可能通過此通路對LPS誘導的RPMCs的EMT發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。我們應用Western blot檢測各組TGF?β/Smad通路關鍵蛋白Smad2、Smad3的表達情況。結(jié)果顯示，LPS組細胞的總Smad2、Smad3表達沒有明顯改變，而p?Smad2、p?Smad3表達明顯升高，而鋅補充能夠明顯降低LPS引起的P?Smad2、p?Smad3的上調(diào)表達。這表明TGF?β/Smad信號通路在鋅離子介導的RPMCs的阻抑EMT過程中起到重要作用（圖5）。

圖5 鋅離子對LPS誘導的Smad2，Smad 3，P?Smad2，P?Smad 3蛋白表達的影響Fig.5 Effect of Zn supplementation on the expression of Smad2，Smad 3，P?Smad2 and P?Smad 3 in the LPS?treated RPMCs

3 討論

腹膜透析是利用腹膜作為半透膜通過彌散和滲透原理清除機體內(nèi)代謝廢物和多余的水分，是終末期腎臟病替代治療的主要手段之一。一直認為，腹膜組織固有的成纖維細胞的激活和浸潤的炎性細胞是引起腹膜結(jié)構(gòu)和功能改變的最主要因素［12］。然而，近年來的研究發(fā)現(xiàn)，長期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導致腹膜間皮細胞發(fā)生向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)分化（EMT）［12］。EMT是一個高度調(diào)控的過程，在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生發(fā)展以及一些慢性炎癥疾病纖維化過程中發(fā)揮重要作用。腹膜間皮細胞的EMT是腹膜透析患者腹膜功能逐漸降低的關鍵因素之一。以往的研究證實，鋅補充能夠抑制或減輕一些動物模型的纖維化和臨床上的慢性炎癥疾病，例如肝纖維化、心肌纖維化、血管纖維化以及系統(tǒng)性纖維化等［9］。相反，鋅缺乏能夠加重或?qū)е吕w維化。文獻證實，終末期腎臟病患者，其中包括血液透析和腹膜透析［7，8］的患者均存在不同程度的鋅缺乏。因此我們有理由推測鋅離子可能對腹膜透析相關的腹膜的纖維化有一定的影響。本實驗中，LPS可以誘導體外培養(yǎng)的RPMCs發(fā)生EMT，而鋅補充可以有效抑制EMT。此外，鋅補充明顯抑制了TGF?β/Smad信號通路，其可能是鋅離子產(chǎn)生抗EMT作用的機制之一。

以往研究表明，多種原因可導致PMCs發(fā)生EMT。例如，以高糖為主的腹透液、TGF?β1、氧化應激產(chǎn)物等［13］。RPMCs間存在著多種連接，其中黏合連接的主要結(jié)構(gòu)成分E?cadherin以膜外段與相鄰的細胞表面同型分子聚合，胞內(nèi)段與膜內(nèi)連環(huán)蛋白（β?catenin）結(jié)合，而連環(huán)蛋白與肌動蛋白結(jié)合錨定微絲束末端于膜內(nèi)面，三者所組成的骨架系統(tǒng)對維持RPMCs層的完整性至關重要［1］。膠原是細胞外基質(zhì)的主要成分，其中膠原Ⅰ具有代表性，其占成纖維細胞和其他細胞合成膠原總量的80%。所以我們選用了collagenⅠ作為觀察的指標，并檢測其蛋白水平的變化。本研究通過免疫熒光檢查顯示，在LPS干預下，RPMCs中成纖維樣細胞表型標志物α?SMA表達明顯增加，同時細胞形態(tài)由典型的上皮形態(tài)逐漸變?yōu)樗笮渭安灰?guī)則形，類似肌成纖維細胞。證實了LPS具有誘導RPMCs發(fā)生EMT的作用。加入Zn?SO4后發(fā)現(xiàn)，與LPS組相比，α?SMA熒光強度明顯減弱，同時細胞形態(tài)改變也明顯減輕，提示ZnSO4具有一定抑制RPMCs的EMT的作用。為了進一步證實ZnSO4的這種作用，我們采用Western blot方法對EMT標記性蛋白進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在LPS干預下，RPMCs的α?SMA 、collagenⅠ蛋白表達顯著上調(diào)，E?cadherin蛋白表達顯著下調(diào)；而應用ZnSO4后RPMCs上述改變顯著得到抑制，進一步表明ZnSO4可以抑制LPS誘導的RPMCs發(fā)生EMT，從而可能抑制LPS誘導的腹膜纖維化的進程。

鋅離子具有抑制多種細胞因子產(chǎn)生，從而在抗凋亡、抗炎及抗纖維化過程中發(fā)揮重要作用［14］。以往的研究證實鋅離子可以降低由乙醇誘導的體外培養(yǎng)的肝細胞TGF?β1的高表達及TGF?β/Smad 信號轉(zhuǎn)導通路的激活進而抑制肝細胞纖維化的發(fā)生［15］。TGF?β1是EMT的關鍵調(diào)節(jié)因子，主要通過Smad信號蛋白來實現(xiàn)信號的胞內(nèi)傳遞。已有許多文獻報道認為Smad信號蛋白在各器官的纖維化中發(fā)揮著重要的作用，如腎、肝、肺、心、皮膚等。最近研究發(fā)現(xiàn)TGF?β1不僅可誘導體外HPMCs發(fā)生EMT而且也可誘導體內(nèi)HPMCs發(fā)生EMT。TGF?β1主要通過 smad 途徑介導 EMT［12］。TGF?β1 通過與TGF?β I型受體結(jié)合進一步激活下游信號通路。其在EMT中主要的目的基因調(diào)節(jié)依賴于smad2、smad3的轉(zhuǎn) 錄 調(diào)節(jié)。在本研究中，LPS可使 TGF?β1、P?smad2、P?smad3 表達顯著上調(diào)，而加入ZnSO4后，TGF?β1，以及P?smad2、P?smad3蛋白表達顯著下調(diào)，提示ZnSO4具有抑制TGF?β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路的作用，從而可能抑制EMT的發(fā)生和發(fā)展。

本研究結(jié)果顯示，LPS可誘導RPMCs發(fā)生EMT，并促進RPMCs致纖維化相關細胞因子高表達。ZnSO4能在一定程度上抑制LPS誘導的RPMCs的EMT，這一作用可能是通過調(diào)節(jié)TGF?β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路實現(xiàn)的。本研究將為明確鋅離子在腹膜透析相關性腹膜纖維化中的作用和相關機制，尋找有效干預腹膜纖維化的關鍵環(huán)節(jié)與分子靶點提供新的科學依據(jù)。

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