王艷麗，朱曉琳，段麗麗，陳杰鵬，牛哲峰，曲迎春，叢培芳，李嶺，張美俠

（1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院臨床藥理教研室，沈陽 110001；2.廣東汕頭保稅區(qū)雙駿生物科技有限公司應(yīng)用生物技術(shù)研究所，廣東 汕頭515071；3.四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳醫(yī)學(xué)研究所，成都 610041）

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率居全球惡性腫瘤的第6位，死亡率居第3位［1］，5年生存率＆lt;5%［2］。肝癌的治療手段不斷豐富，但目前其治療仍然以手術(shù)治療為主，配合以放療、化療、生物治療等多種治療手段。到目前為止，肝癌的化療效果還不盡如人意。紫杉烷類的代表藥物紫杉醇（pacli?taxel，PTX）是從紫杉樹樹皮中提取的一種天然植物類抗腫瘤藥物，是乳腺癌、卵巢癌及非小細(xì)胞肺癌的一線和二線治療藥物，并可用于治療頭頸癌、食管癌、精原細(xì)胞瘤和復(fù)發(fā)性非霍奇金淋巴瘤等［3～7］。維康醇是在PTX菌種發(fā)酵過程中獲得的產(chǎn)量較大的一種新型單體化合物。研究證實(shí)，維康醇對(duì)前列腺癌、胃癌、白血病等惡性腫瘤有抑制作用［8～10］。本研究組前期研究結(jié)果證實(shí)其對(duì)胰腺癌、卵巢癌等腫瘤細(xì)胞株也具有增殖抑制作用，并具有引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，但它對(duì)肝癌細(xì)胞的作用未見報(bào)道。本研究擬應(yīng)用MTT法、流式細(xì)胞術(shù)等方法，研究維康醇對(duì)肝癌細(xì)胞增殖抑制、細(xì)胞周期阻滯及細(xì)胞凋亡的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI?1640培養(yǎng)液（GIBCO公司，美國），胎牛血清（天津?yàn)笊锕?，中國），MTT（methylthiazolyl tetrazolium）、碘化丙錠（propidium lodide，PI）（Amres?co公司，美國），Annexin V?FITC試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，中國）。人肝癌細(xì)胞系HepG2由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供。維康醇由廣東省汕頭市雙駿生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 MTT法檢測細(xì)胞增殖：取對(duì)數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞制成細(xì)胞懸液（5×104/mL），接種于96孔板中（100 μL/孔）。培養(yǎng)24 h后加入以含10%FBS的RPMI?1640培養(yǎng)液稀釋的藥物，終濃度分別為3、10、30 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)包括實(shí)驗(yàn)組、溶劑對(duì)照組、空白對(duì)照組，藥物作用24、48、72 h后，加入MTT（5 mg/L），每孔10 μL，37 ℃孵育4 h，加入 100 μL 10%SDS（含 10 mmol/L HCl）以終止反應(yīng)，37℃過夜后使用酶標(biāo)儀檢測570 nm波長處的吸光度值（OD值）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期：HepG2細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)（1×106/孔），貼壁過夜，次日加入維康醇，濃度分別為3、10、30 μmol/L，同時(shí)設(shè)溶劑對(duì)照組。藥物作用48 h后，0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，預(yù)冷的70%乙醇4℃固定細(xì)胞過夜。用100 mg/mL PI（含50 μg/mL RNA酶）溶液重懸細(xì)胞，室溫下避光染色15 min后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期檢測。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：HepG2細(xì)胞接種于6孔板中（1×106/孔）過夜，分別用3、10、30 μmol/L維康醇及溶劑處理，48 h后收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS離心洗滌2～3次。將細(xì)胞重懸于250 μL結(jié)合緩沖液中，加入10 μL Annnexin V?FITC和5 μL PI，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析、LSD?t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＆lt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：不同濃度（3、10、30 μmol/L）及作用時(shí)間（24、48、72 h）條件下，維康醇均對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且隨著藥物濃度的升高及作用時(shí)間的延長抑制率也相應(yīng)增加，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。說明維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯增殖抑制作用，并呈時(shí)間和劑量依賴性。見圖1。

圖1 維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of alternol on the proliferation of HepG2 cells

2.2 流式細(xì)胞儀檢測維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示：30 μmol/L維康醇作用于HepG2細(xì)胞48 h后，處于G2/M期的細(xì)胞比例明顯升高［30 μmol/L維康醇處理組的G2/M期的細(xì)胞為（16.39±0.5）%，對(duì)照組的G2/M期的細(xì)胞為（9.4±1.59）%］，同時(shí)伴隨G1/G0期的細(xì)胞比例下降［30 μmol/L維康醇處理組為（60.23±2.1）%，對(duì)照組為（76.92±8.39）%］，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.01）。見圖2。

2.3 流式細(xì)胞儀分析維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用

Annexin V?FITC/PI染色檢測結(jié)果顯示：維康醇可以引起HepG2細(xì)胞凋亡，30 μmol/L維康醇作用于HepG2細(xì)胞48 h后的細(xì)胞凋亡率為（31.5±5.78）%，溶劑對(duì)照組為（6.98±2.43）%。見圖3。

3 討論

HCC的發(fā)病率占所有腫瘤疾病的5%，全世界每年約600 000人死于肝癌［2］。目前HCC仍以手術(shù)治療為主，但治療率低、復(fù)發(fā)性高、預(yù)后差?；瘜W(xué)藥物治療是治療肝癌尤其是無手術(shù)指征的晚期肝癌的重要方法，但常因耐藥和復(fù)發(fā)導(dǎo)致肝癌化療失?。?1］。由于肝癌的不良預(yù)后，研究開發(fā)新的有效的抗肝癌新藥仍然是未來的研究熱點(diǎn)。

圖2 維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞周期的影響Fig.2 Effect of alternol on cell?cycle distribution of HepG2 cells

圖3 維康醇對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effects of alternol on HepG2 cells apoptosis

惡性腫瘤的無限增殖特性與細(xì)胞增殖周期的失控有關(guān)［12］。正常的細(xì)胞周期由G1?S?G2?M組成，其間存在G1/S和G2/M 2個(gè)重要調(diào)控點(diǎn)，其調(diào)控功能的喪失導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。多數(shù)化療藥物均可引起細(xì)胞周期阻滯，達(dá)到抗腫瘤的作用。本研究結(jié)果顯示：維康醇引起肝癌HepG2細(xì)胞在G2/M期比例明顯增加，并伴隨G1/G0期的細(xì)胞比例下降，證實(shí)維康醇對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞存在細(xì)胞周期阻滯現(xiàn)象。

研究證實(shí)，細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡既相互聯(lián)系，又相互獨(dú)立。細(xì)胞凋亡是指真核細(xì)胞為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因調(diào)控的細(xì)胞自主性有序性的死亡，它涉及一系列基因的激活、表達(dá)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。細(xì)胞凋亡的發(fā)生通常是細(xì)胞先阻滯在細(xì)胞周期的某一時(shí)相，繼而在此期發(fā)生細(xì)胞凋亡，從而表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅是由于細(xì)胞增殖的失控，也與細(xì)胞凋亡受阻相關(guān)。因此抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡是大多數(shù)化療藥物抗腫瘤的主要作用機(jī)制［13～15］。本研究結(jié)果證實(shí)30 μmol/L維康醇作用于HepG2細(xì)胞可誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

綜上所述，維康醇對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞的增殖具有明顯抑制作用，且呈濃度、時(shí)間依賴性。維康醇作用于HepG2細(xì)胞后，引起G2/M期細(xì)胞周期阻滯，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。維康醇通過引起細(xì)胞周期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制了肝癌HepG2細(xì)胞的增殖，從而達(dá)到抗肝癌作用。但其具體的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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