閆榮，羅曉光，張堯，李宇鳳，馮娟

（中國醫(yī)科大學(xué)1.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110004；2.附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，沈陽 110001）

近年來的國際研究顯示，神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSC）既能在體外增殖，又能保持未分化狀態(tài)。在誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)下，可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞［1］，其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，如帕金森?。≒arkinson dis?ease，PD）的損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用，并且一直是此領(lǐng)域的研究前沿［2］。越來越多的研究證明星形膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte，AS）會通過改變自身特性來適應(yīng)不同的外界環(huán)境信號刺激，這種改變不但有大小、形態(tài)和數(shù)目上的改變，也有分泌功能的改變，如GDNF、NGF、BDNF、NT?3等表達(dá)上調(diào)［3］。近年來認(rèn)識到星形膠質(zhì)細(xì)胞在突觸形成中發(fā)揮重要作用［4］。有研究證明帕金森病，腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞是對多巴胺能神經(jīng)元起保護(hù)作用［5］。但是，在帕金森病腦內(nèi)微環(huán)境中，星形膠質(zhì)細(xì)胞與受到1?甲基?4苯基-吡啶離子（MPP+）毒性損傷的神經(jīng)元相互作用后神經(jīng)營養(yǎng)基因表達(dá)的變化至今仍未清楚，以及對神經(jīng)干細(xì)胞的突觸素和生長相關(guān)蛋白43（GAP?43）的影響有待探討。本研究將研究對象單一純化，利用MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，然后與星形膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育2 d，收集星形膠質(zhì)細(xì)胞，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)素家族蛋白基因（BDNF mRNA、NGF mRNA和NT?3 mRNA）表達(dá)變化，以及星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液對神經(jīng)干細(xì)胞突觸素、GAP?43表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

新生2 d Wistar大鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)動物部，PC12細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞生物研究所。Fal?con Cell Culture Insert（基因公司，美國）；總RNA提取試劑Trizol Reagent，RT?PCR試劑盒購自TaKaRa公司，引物由TaKaRa公司合成，其余試劑為國產(chǎn)分析純；1?甲基?4苯基－吡啶離子（MPP+）（Sigma公司）；抗體：小鼠抗鼠突觸素（基因公司，美國），兔抗鼠生GAP?43、小鼠抗鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）、兔抗鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），兔抗鼠nestin，F(xiàn)ITC、cy3（羊抗小鼠、羊抗兔）標(biāo)記二抗（武漢博士德公司）。

1.2 方法

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定：取生后2 d Wistar大鼠腦皮質(zhì)，0.25%胰蛋白酶消化、離心、差速貼壁去除成纖維細(xì)胞，含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每2～3 d換液，細(xì)胞長至80%～90%融合后，置于37℃搖床中振蕩2次（250 r/min，第1次：12～14 h；第2次：30～60 min）。為進(jìn)一步純化，可重復(fù)振蕩傳代。星形膠質(zhì)細(xì)胞純度=GFAP陽性細(xì)胞/（NSE陽性細(xì)胞+GFAP陽性細(xì)胞）×100%。純度達(dá)95%以上，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。將純化的星形膠質(zhì)細(xì)胞以1×107/mL密度隨機(jī)接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入含血清DMEM培養(yǎng)液800 μL/孔，備用后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 第一步驟

（1）PC12細(xì)胞的培養(yǎng)和2.0 mmol/L MPP+誘導(dǎo)：用含10%馬血清和5%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞鋪滿70%～90%瓶底時(shí)用0.25%胰酶消化，按1∶3進(jìn)行傳代。將PC12細(xì)胞以1×107/mL密度隨機(jī)接種于Falcon Cell Culture Insert中，用2.0 mmol/L MPP+分別處理0 h、24 h、48 h、72 h、96 h后，分為2部分：一部分應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，每個時(shí)間點(diǎn)設(shè)5孔；另一部分換液，加入含血清RPMI 1640培養(yǎng)液200 μL/孔，備用進(jìn)行下面實(shí)驗(yàn)。

（2）實(shí)驗(yàn)分組：將各組Falcon Cell Culture Insert（均含血清RPMI 1640培養(yǎng)液200 μL/孔）放入與其相配的24孔培養(yǎng)板內(nèi)（均含血清DMEM培養(yǎng)液800 μL/孔）2 d，達(dá)到共育目的。具體如下：A組（星形膠質(zhì)細(xì)胞組），即Falcon Cell Culture Insert不含PC12細(xì)胞，24孔培養(yǎng)板內(nèi)含星形膠質(zhì)細(xì)胞。B組（PC12+星形膠質(zhì)細(xì)胞組），即Falcon Cell Culture Insert含PC12細(xì)胞，24孔培養(yǎng)板內(nèi)含星形膠質(zhì)細(xì)胞。C1組～C5組［MPP+誘導(dǎo)PC12（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）星形膠質(zhì)細(xì)胞組］，即Falcon Cell Culture Insert含MPP+分別誘導(dǎo)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h PC12細(xì)胞，24孔培養(yǎng)板內(nèi)含星形膠質(zhì)細(xì)胞。D1組～D5組［MPP+誘導(dǎo)PC12（0 h、24 h、48 h、72 h、96 h）組］，即Falcon Cell Culture Insert含MPP+分別誘導(dǎo)0 h、24 h、48 h、72 h、96 h PC12細(xì)胞，24孔培養(yǎng)板內(nèi)不含星形膠質(zhì)細(xì)胞。E組（MPP+誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞），即Falcon Cell Culture Insert不含PC12細(xì)胞，24孔培養(yǎng)板內(nèi)含MPP+誘導(dǎo)48 h的星形膠質(zhì)細(xì)胞。每組設(shè)5孔。

（3）收集各組細(xì)胞和細(xì)胞條件培養(yǎng)液：每孔液體總量為1 mL，48 h后移去Falcon cell culture In?sert，小心收集上清液1 mL/孔，移入無菌Eppendorf管，離心3 000 r/min 20 min，再將上清液移入另一無菌Eppendorf管，-20℃冷藏，備用。小心收集24孔板內(nèi)各組細(xì)胞，PBS洗滌3次后，加入Trizol 1 mL，移入Eppendorf管，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

（4）流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡分析：將第一部分收集的Falcon Cell Culture Insert中的PC12細(xì)胞，PBS沖洗3次，70%冷乙醇固定，加入PI染液，4℃避光30 min，流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，BD，美國）檢測，用Cell Quest3.0軟件分析。

（5）RT?PCR檢測各組收集的細(xì)胞BDNF mRNA，NGF mRNA，NT?3 mRNA：

①總RNA的提取與定量：按Trizol試劑說明書要求提取總RNA。紫外可見光分光光度計(jì)測OD值，A260 nm/A280 nm為1.8～2.0，并用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，調(diào)節(jié)后樣本終濃度為1 μg/μL。提取總RNA置于-70℃保存。

② BDNF，NGF，NT?3引物合成序列：大鼠β?ac?tin：Sense 5′?GCCAACCGTGAAAAGATG?3′，700（bp），Antisense 5′?CCAGGATAAGCCACCAAT?3′；NGF Sense 5′?CGGCGTACAGGCAGAACCGTACA CAG?3′，335?360 410（bp），Antisense 5′?GTGTGGT TGGAGATAAGACCACAGCCACAG ?3′，714?744（bp）；BDNF Sense 5′?CAGTGGACATGTCCGGTGGG ACGGTC?3′，545?570 533（bp），Antisense 5′?GTGT GGTTGGAGATAAGACCACAGCCACAG?3′，1051?1077（bp）；NT3 Sense 5′?GCAACAGACACAGAACTA CTA?3′，331?351 232（bp），Antisense 5′?GCCTGT GGGTGACCGACAAGT?3′，542?562（bp）。

③ 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：取各組樣本（RNA）1 μL，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書要求操作，總反應(yīng)體積10 μL，30 ℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min，4℃冰箱保存。

④PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，完成30個循環(huán)后，72℃再延伸10 min，4℃保留1 min。

⑤在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.8%的瓊脂糖凝膠上電泳。

⑥用電泳凝膠成像系統(tǒng)觀察拍照。

⑦產(chǎn)物分析：電泳圖譜在電泳凝膠成像分析工作站，應(yīng)用Fluorchem V2.0軟件掃描。PCR產(chǎn)物溴乙錠染色后強(qiáng)度以Marker DL 2 000為分子量標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)參照β?actin熒光強(qiáng)度值標(biāo)化BDNF，NGF，NF?3基因mass值，得到相對含量進(jìn)行分析。用下列公式表示：BDNF/NGF/NT?3 mRNA 相對含量=BDWF/NGF/NT?3密度/β?actin密度×100。

1.2.3 第二步驟

（1）神經(jīng)干細(xì)胞分離，培養(yǎng)及鑒定：取懷孕14 d Wister大鼠1只，分離胎鼠腦皮質(zhì)組織，收入D?Hanks液中沖洗，剪碎腦組織，過濾、反復(fù)吸打、離心，加入20 μg/L bFGF和20 mL/L B27的DMEM/F12培養(yǎng)液，置入37℃CO2孵箱培養(yǎng)，2～3 d換液1次，6～7 d傳代1次。再分別以1×107/mL密度接種于多聚賴氨酸處理的24孔培養(yǎng)板和25 cm2培養(yǎng)瓶中，備用下面實(shí)驗(yàn)。胚胎大鼠皮質(zhì)NSC nestin免疫熒光鑒定，Ⅰ抗選用兔抗大鼠nestin單抗，Ⅱ抗選用FITC（羊抗兔）標(biāo)記的IgG。

（3）實(shí)驗(yàn)分組：取前面實(shí)驗(yàn)備用的A組、B組，C1～C5組、D1組～D5組和E組細(xì)胞條件培養(yǎng)液（ACM），以1∶3比例同DMEM/F12培養(yǎng)基混合，分別加入備用的含有NSC（1×107/mL密度）的24孔培養(yǎng)板中。依次分別設(shè)為Ⅰ組（A組+NSC）、Ⅱ組（B組+NSC）、Ⅲ組～Ⅶ組［（C1組～C5組）+NSC］、Ⅷ組（NSC組，不含細(xì)胞條件培養(yǎng)液）、Ⅸ組～ⅩⅢ組［（D1組～D5組）+NSC］和ⅩⅣ組（E組＋NSC），每組設(shè)5個孔/瓶。

（4）免疫熒光染色檢測神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）突觸素（SYN）和GAP?43的表達(dá)：在24孔培養(yǎng)板中，PBS洗1次（5 min），4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3次（5 min），分別用不含曲拉通的BSA和含曲拉通的BSA封閉30 min和20 min，加入Ⅰ抗，37℃搖床孵育2 h，PBS洗3次（5 min），加入Ⅱ抗，避光，孵育30 min，PBS洗3次（5 min），加入熒光保護(hù)油，在熒光顯微鏡下觀察，每張片分別選取10個不同視野照相。Ⅰ抗選用突觸素和GAP?43（1∶100），Ⅱ抗選用FITC、cy3標(biāo)記的IgG。每孔隨機(jī)選5個視野拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，組間差異采用兩因素析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＆lt;0.05為差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及免疫熒光染色鑒定

培養(yǎng)7～9 d即可達(dá)90%融合，呈鋪路石樣外觀，免疫熒光GFAP染色呈強(qiáng)陽性，NSE染色呈陰性，星型膠質(zhì)細(xì)胞純度達(dá)98%以上。

2.2 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡率

在MPP+作用0 h、24 h時(shí)間點(diǎn)，PC12細(xì)胞凋亡率較低，48 h達(dá)高峰，以后逐漸降低，48 h時(shí)PC12細(xì)胞凋亡率與其他時(shí)間點(diǎn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05，見圖1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測PC12細(xì)胞凋亡率Fig.1 The apoptosis rates of 1 ?methyl?4 phenyl pyridinium（MPP+）?induced PC12 cells were measured by Flowcytometry

2.3 RT?PCR檢測各組細(xì)胞BDNF mRNA，NGF mRNA，NT?3 mRNA表達(dá)結(jié)果

A組、B組、C1組、C2組、和E組BDNF mRNA表達(dá)較低，但C3組、C4組、C5組BDNF表達(dá)明顯升高，D1組～D5組未檢測到BDNF mRNA表達(dá)，C3組與A組、B組、C1組、C2組、D1組～D5組和E組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05），C3組分別與C4 組、C5組比較P＆gt;0.05。NGF mRNA：在A組～E組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆gt;0.05），D1組～D5組未檢測到NGF mRNA。NT?3 mRNA，在各組中未測出（P＆gt;0.05）。見表1、圖2～5。

2.4 神經(jīng)干細(xì)胞分離，培養(yǎng)及鑒定

胚胎大鼠大腦皮質(zhì)原代細(xì)胞在無血清含bFGF DMEM/F12培養(yǎng)液中，第1天呈比較均勻單個分散生長，48 h后即可形成懸浮樣集落狀生長的細(xì)胞團(tuán)，經(jīng)多次傳代后，部分細(xì)胞仍然呈集落樣生長，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞團(tuán)逐漸增大。Nestin免疫熒光染色陽性。

表1 RT?PCR半定量檢測各組樣本BDNF mRNA、NGF mRNA和NT?3 mRNA陽性相對含量（±s）Tab.1 The expression of BDNF mRNA、NGF mRNA和NT?3 mRNA in all groups were measured by RT?PCR（±s）

表1 RT?PCR半定量檢測各組樣本BDNF mRNA、NGF mRNA和NT?3 mRNA陽性相對含量（±s）Tab.1 The expression of BDNF mRNA、NGF mRNA和NT?3 mRNA in all groups were measured by RT?PCR（±s）

Ps：C3 group compared to A group，B group，C1 group，C2 group，D1?D5 group，E group，P＆lt;0.05；C3 group compared to C4 group and C5 group，P＆gt;0.05；C3 group compared to other groups，P＆gt;0.05；C3 group compared to other groups，P＆gt;0.05.1）P＆lt;0.05.

Groups BDNF mRNA（%） NGF mRNA（%） NT?3 mRNA（%）A group：astrocyte 9.99±2.49 10.11±2.11 1.39±0.59 B group：PC12+astrocyte 12.02±1.97 12.15±1.81 1.41±0.21 C1 group：MPP+?PC12（0 h）+astrocyte 12.38±2.39 12.88±2.24 1.59±0.41 C2 group：MPP+?PC12（24 h）+astrocyte 30.12±3.81 16.89±0.73 1.61±0.72 C3 group：MPP+?PC12（48 h）+astrocyte 93.96±4.89 18.28±0.61 1.73±0.37 C4 group：MPP+?PC12（72 h）+astrocyte 94.12±1.89 18.67±2.02 1.79±0.89 C5 group：MPP+?PC12（96 h）+astrocyte 95.14±1.69 18.83±1.69 1.79±0.24 D1 group：MPP+?PC12（0 h） 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 D2 group：MPP+?PC12（24 h） 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 D3 group：MPP+?PC12（48 h） 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 D4 group：MPP+?PC12（72 h） 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 D5 group：MPP+?PC12（96 h） 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 E group：MPP+astrocyte 0.01±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00

2.5 免疫熒光染色檢測神經(jīng)干細(xì)胞突觸素和GAP?43的表達(dá)

在Ⅰ～Ⅳ組、Ⅸ～ⅩⅢ組和ⅩⅣ組突觸素、GAP?43表達(dá)較低；但在Ⅴ組表達(dá)明顯升高；在Ⅷ組未見到突觸素、GAP?43表達(dá)；Ⅴ組與其他各組比較差異明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＆lt;0.05）。見圖6～8。

3 討論

隨著國內(nèi)外對神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）的研究逐漸深入，人們發(fā)現(xiàn)NSC具有幾方面優(yōu)點(diǎn)：（1）增殖能力旺盛；（2）多向分化潛能，近來的研究發(fā)現(xiàn)，在特定的培養(yǎng)條件下，NSC已經(jīng)成功地被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［1］；（3）可根據(jù)不同需要進(jìn)行基因調(diào)控。正是由于上述特點(diǎn)，神經(jīng)干細(xì)胞為中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床細(xì)胞治療和基因治療提供了新的細(xì)胞來源。

圖2 RT?PCR檢測各組β?actin mRNA表達(dá)Fig.2 The expression of β?actin mRNA in all groups were measured by RT?PCR

圖3 RT?PCR檢測各組BDNF mRNA表達(dá)Fig.3 The expression of BDNF mRNA in all groups were measured by RT?PCR

圖4 RT?PCR檢測各組NGF mRNA表達(dá)Fig.4 The expression of NGF mRNA in all groups were measured by RT?PCR

圖5 RT?PCR檢測各組NT?3 mRNA 表達(dá)Fig.5 The expression of NT?3 mRNA in all groups were measured by RT?PCR

近年來嘗試用NSC移植治療帕金森?。≒D）［2］。但是PD病理狀態(tài)下神經(jīng)細(xì)胞（如數(shù)量龐大的星形膠質(zhì)細(xì)胞）對移植NSC的突觸形成影響如何，是什么參與了此過程，尚待研究。

圖6 各組細(xì)胞條件培養(yǎng)液對神經(jīng)干細(xì)胞突觸素、GAP?43表達(dá)的影響（±s）Fig.6 The expression of SYN and GAP?43 protein of NSC were affected by the collected cells?conditioned medium in the all groups（±s）

圖7 免疫熒光檢測Ⅴ組NSC突觸素表達(dá) ×400Fig.7 The expression of synaptophysin inⅤgroup were detected by immunofluorescen×400

圖8 免疫熒光檢測Ⅴ組NSC GAP?43表達(dá) ×400Fig.8 The expression of GAP?43 in Ⅴ group were detected by immunofluorescen×400

近年來，對數(shù)量龐大的星形膠質(zhì)細(xì)胞不斷有了新的認(rèn)識，不同的疾病有著不同環(huán)境信號刺激，星形膠質(zhì)細(xì)胞會對其產(chǎn)生不同的反應(yīng)［3］。有研究發(fā)現(xiàn)PD腦內(nèi)，激活的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)出現(xiàn)炎性反應(yīng)［7］，黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的生存，部分是通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞［8］，星形膠質(zhì)細(xì)胞很多基因、蛋白質(zhì)和相關(guān)信號通路表達(dá)是上調(diào)的，其中包括一些神經(jīng)營養(yǎng)因子［9］。其次，對星形膠質(zhì)細(xì)胞的新認(rèn)識就是促進(jìn)突觸形成、加速突觸傳遞、調(diào)節(jié)突觸活動，在突觸可塑中發(fā)揮重要作用。包括突觸形態(tài)、結(jié)構(gòu)、數(shù)目、電生理、突觸蛋白免疫表達(dá)、突觸囊泡的循環(huán)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放等方面進(jìn)行研究［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，在PD腦內(nèi)，突觸結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分子學(xué)發(fā)生改變，星形膠質(zhì)細(xì)胞也發(fā)生形態(tài)、生化改變［10］。

突觸是神經(jīng)元之間信息傳遞的特化結(jié)構(gòu)，是形成神經(jīng)活動的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。目前已鑒定出與突觸有關(guān)的突觸蛋白有10余種。其中突觸素是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì)，分子量為3 kDa，是突觸囊泡中含量最豐富的兩類蛋白之一。突觸素的功能是調(diào)節(jié)突觸囊泡貯存和釋放神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸囊泡導(dǎo)入轉(zhuǎn)運(yùn)，突觸囊泡再循環(huán)，參與突觸的形成和突觸重塑。GAP?43是突觸前膜蛋白，分子量為24 kDa。GAP?43的功能是參與神經(jīng)纖維的生長、再生和分化，參與突觸可塑性，對調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放有重要影響。在PD患者，突觸核蛋白（SYN）是散發(fā)性和家族性PD的發(fā)病機(jī)制中的中心角色。SYN聚集和氧化應(yīng)激相關(guān)聯(lián)，并增進(jìn)彼此的毒性［5，13］。因此突觸素和GAP?43不但可以作為突觸蛋白分子標(biāo)記，而且也可作為神經(jīng)突觸可塑性的特異性標(biāo)記之一，即可作為突觸的功能性標(biāo)記［11，12］。

近來的研究發(fā)現(xiàn)在大鼠PD模型，中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)可見眾多基因表達(dá)變化，為了避免PD腦內(nèi)多種錯綜復(fù)雜的微環(huán)境因素干擾，我們將研究對象單一純化，利用1?甲基?4苯基?吡啶離子（MPP+）誘導(dǎo)類型單一，又可穩(wěn)定傳代的具有神經(jīng)細(xì)胞特征的PC12細(xì)胞凋亡后與純化的原代培養(yǎng)的大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞共同孵育，由于神經(jīng)營養(yǎng)家族是20余種神經(jīng)營養(yǎng)因子中最具代表性的一族，因此，我們應(yīng)用RT?PCR技術(shù)觀察了大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)營養(yǎng)素家族基因（BDNF、NGF、NT?3）表達(dá)變化。然后，應(yīng)用星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液誘導(dǎo)NSC，應(yīng)用免疫熒光觀察NSC突觸素和GAP?43表達(dá)變化。

在第一步驟實(shí)驗(yàn)中，BDNF mRNA表達(dá)：A組～C5組各組BDNF mRNA陽性相對含量變化趨勢與本次實(shí)驗(yàn)的MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率變化相吻合，即星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)隨著MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡率增高而增加，C3組BDNF mRNA陽性相對含量明顯上調(diào)達(dá)高峰，48 h后降低減少，說明大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)明顯上調(diào)可能與MPP+對PC12神經(jīng)毒性損傷有關(guān)，推測在MPP+誘導(dǎo)PC12凋亡同時(shí)分泌某種細(xì)胞因子增加，刺激大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性BDNF mRNA表達(dá)增加。D1～D5組未檢測到BDNF mRNA，說明PC12細(xì)胞不表達(dá)BDNF mRNA。E組未檢測到BDNF mRNA，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞直接受到MPP+神經(jīng)毒性損傷后明顯影響了BDNF mRNA表達(dá)。

NGF mRNA表達(dá)：A組～C5組各組均可見到NGF mRNA低量表達(dá)，各組之間NGF mRNA陽性相對含量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（P＆gt;0.05）。由此可以看到PC12經(jīng)MPP+誘導(dǎo)后，不能刺激大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞NGF mRNA表達(dá)變化。D1～D5組未檢測到NGF mRNA，說明PC12細(xì)胞不表達(dá)NGF mRNA。E組未檢測到NGF mRNA，說明星形膠質(zhì)細(xì)胞直接受到MPP+神經(jīng)毒性損傷后影響了NGF mRNA表達(dá)。

NT?3 mRNA：在各組均未見到NT?3 mRNA表達(dá)。說明大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)NT?3 mRNA。

綜上所述，我們可以推測大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)變化，可能與MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡有關(guān)，但是其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。其次，來源于大鼠皮層區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞與經(jīng)過MPP+誘導(dǎo)后PC12相互作用后，主要以BDNF mRNA表達(dá)上調(diào)為主，NGF mRNA表達(dá)無變化，NT?3 mRNA不表達(dá)。我們認(rèn)為PC12受到Aβ神經(jīng)毒性損傷后可以刺激來源于大鼠皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞有選擇性神經(jīng)營養(yǎng)素家族基因表達(dá)。

最后的實(shí)驗(yàn)觀察到，NSC本身不表達(dá)突觸素和GAP?43，細(xì)胞間無突觸形成；星形膠質(zhì)細(xì)胞、PC12細(xì)胞和MPP+作用48 h星形膠質(zhì)細(xì)胞能促進(jìn)NSC少量表達(dá)突觸素和GAP?43；但是與MPP+誘導(dǎo)48 h后PC12細(xì)胞共育的星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液NSC突觸蛋白（突觸素和GAP?43）表達(dá)明顯增高，說明PD病理狀態(tài)下的星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠促進(jìn)NSC突觸蛋白表達(dá)明顯增高。

本研究觀察到Ⅰ組?Ⅶ組中NSC突觸素、GAP?43表達(dá)變化趨勢與RT?PCR檢測A組～C5組星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)變化趨勢相一致。因此分析I組～Ⅶ組NSC突觸素、GAP?43表達(dá)可能與最初MPP+誘導(dǎo)PC?12凋亡、星形膠質(zhì)細(xì)胞BDNF mRNA表達(dá)有關(guān)。

近年來提出，BDNF在神經(jīng)細(xì)胞生存、維護(hù)和再生中發(fā)揮重要作用，在神經(jīng)系統(tǒng)變性病中是重要的治療方向［14，15］。國內(nèi)外研究指出BDNF可以調(diào)節(jié)突觸囊泡蛋白的表達(dá)和神經(jīng)突觸調(diào)節(jié)密度；BDNF通過調(diào)節(jié)突觸的數(shù)量，促進(jìn)軸突更多地分叉，增加突觸可分布的領(lǐng)域，來提高神經(jīng)元環(huán)路結(jié)構(gòu)和功能上的復(fù)雜性；BDNF可以調(diào)節(jié)突觸囊泡的數(shù)量；BDNF還調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞和電生理特性。以上的研究結(jié)果支持我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，與MPP+誘導(dǎo)PC12凋亡共育的星形膠質(zhì)細(xì)胞可能通過BDNF mRNA增加，可能與NSC突觸蛋白的表達(dá)增加有關(guān)。

在本實(shí)驗(yàn)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮其神經(jīng)營養(yǎng)作用，起修補(bǔ)代償作用。此外，來源于新生大鼠皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞與受到MPP+神經(jīng)毒性損傷的PC12細(xì)胞體外相互作用后，能夠有選擇性神經(jīng)營養(yǎng)素家族基因表達(dá)，可能與星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域異質(zhì)性有關(guān)。

總之，綜合全部實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看到受到MPP+神經(jīng)毒性損傷的PC12細(xì)胞能夠刺激來源于大鼠皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，BDNF mRNA表達(dá)上調(diào)，受到星形膠質(zhì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)后的NSC突觸素、GAP?43表達(dá)增加。可以推測PD病理狀態(tài)下，MPP+誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡的同時(shí)釋放了某種細(xì)胞刺激因子，后者刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增強(qiáng)一些基因表達(dá)，其中來源于大鼠皮層的星形膠質(zhì)細(xì)胞以BDNF為神經(jīng)素家族代表，BDNF可能通過某一信號途徑傳遞到NSC核內(nèi)，通過一系列相應(yīng)基因和蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)NSC突觸蛋白的表達(dá)。因此推測來源于大鼠皮質(zhì)的反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞有助于促進(jìn)來源于自身骨髓的NSC突觸蛋白的表達(dá)，并且BDNF可能參與了此過程，這可能為PD反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)修復(fù)機(jī)制又增添了一小部分內(nèi)容，更重要的是為NSC應(yīng)用于臨床治療PD提供了一部分基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，為NSC修補(bǔ)替代治療PD增加了可能性。

PD腦內(nèi)微環(huán)境中各種神經(jīng)細(xì)胞對NSC生物學(xué)作用是錯綜復(fù)雜的，受時(shí)間、空間、細(xì)胞基質(zhì)和其他微環(huán)境因素影響和限制。NSC能否替代變性神經(jīng)元及其機(jī)制都有待進(jìn)一步探索。

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