王添，都鎮(zhèn)先，張海燕，鄧娓娓

（中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院1.內分泌與代謝性疾病科；2.老年病干診科，沈陽110001）

脂聯(lián)素，已知的有ACRP30、GBP28和Adipo Q，是在白色脂肪組織中特異性表達的一種補充因子，可提高脂肪酸氧化及胰島素敏感性［1］。最近研究證實脂聯(lián)素在調節(jié)葡萄糖和脂質代謝中起著重要的作用［2，3］。一些研究證實脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α） 在脂肪細胞中表達呈負相關，對胰島素抵抗的調節(jié)作用相反［1，4，5］。因此，準確理解這些脂肪因子的關系及其調節(jié)機制將有助于提高胰島素相關代謝性綜合征的治療水平。已有報道白藜蘆醇能夠拮抗TNF-α抑制脂聯(lián)素的生成［6］，但是這種拮抗機制仍不清楚，本研究采用白藜蘆醇、TNF-α單獨或者聯(lián)合作用脂肪細胞3T3-L1，檢測脂聯(lián)素mRNA表達及釋放、PPAR-γmRNA表達及活性，為白藜蘆醇防治2型糖尿病及代謝綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究試劑

重組TNF-α購于美國Biosource公司。白藜蘆醇、異丁基甲基黃嘌呤（isobutylmethylxanthine，IBMX）、地塞米松和胰島素購于美國Sigma公司。3T3-L1前脂肪細胞購于美國標準生物品收藏中心（ATCC）。

1.2 3T3-L1細胞培養(yǎng)和分化

細胞于含10%胎牛血清的DMEM（美國Invit－rogen公司）中培養(yǎng)，以濃度為1×106/孔在6孔培養(yǎng)皿中培養(yǎng)3 d。在DMEM中加入IBMX（0.5 mmol/L）、地塞米松（5 μmol/L）和胰島素（10 mg/L）誘導分化，誘導2 d后更換誘導培養(yǎng)液。在含有10%胎牛血清和10 mg/L胰島素的DMEM中再誘導2 d后，用含有10%胎牛血清的DMEM每2 d更換培養(yǎng)液。在誘導分化的12～14 d，細胞用于后續(xù)實驗。用原位油紅O染色確定細胞的分化情況，具體操作按照油紅O染色試劑盒說明書進行。超過95%的3T3-L1細胞呈脂肪細胞表型時可進行后續(xù)實驗。

1.3 干預實驗及分組

（1）用白藜蘆醇（0，5，10，20，50 μmol/L）培養(yǎng)分化3T3-L1脂肪細胞24 h后，用實時定量PCR法檢測白藜蘆醇對過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptors，PPAR-γ）和脂聯(lián)素基因表達的影響；（2） 用 TNF-α（0，1.0，2.5，5.0，10.0，20.0 μg/L）培養(yǎng)分化3T3-L1 脂肪細胞24 h，用實時定量PCR法檢測各組TNF-α對脂聯(lián)素基因的表達；（3）在細胞分化 6～8 d，用白藜蘆醇（0，5，10，20，50 μmol/L）孵育3T3-L1 脂肪細胞 8 h。然后用或不用 TNF-α（10 ng/mL）孵育24 h，實時定量 PCR 法檢測各組脂聯(lián)素基因的表達；（4）設立空白對照組、TNF-α組和白藜蘆醇+TNF-α組。在分化6～8 d時，用白藜蘆醇（20 μmol/L）或培養(yǎng)液孵育3T3-L1脂肪細胞 8 h，然后用 TNF-α（10 μg/L）或培養(yǎng)液孵育24 h，收集各組細胞，用實時定量PCR法檢測PPAR-γ基因表達。

1.4 實時定量PCR法

收集各組3T3-L1脂肪細胞，參照說明書，采用異硫氰酸肌法提取總RNA，用12～18的oligo（dT）和super scriptⅡ進行逆轉錄，用雙標記熒光探針混合物在ABI prism7500自動序列分析系統(tǒng)中進行實時定量PCR分析，每組重復3次。PPAR-γ基因引物特異序列為上游5′-ATGGGTGAAACTCTGGGA-3′和下游5′-TCGGCACTCAATGGCCAT-3′。脂聯(lián)素基因引物特異序列為上游5′-TTGGTCCTAAGGGAG ACATC-3′和下游5′-CAGTGGAGCCATCATAGTGG-3′。β-actin作為內參照，其引物特異序列為上游5′-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3′和下游5′-GGAT CTTCATGAGGTAGTCAG-3′。PCR反應條件為變性95℃15 s，退火 60℃ 4 min，延伸 60℃ 4 min，30個循環(huán)。兩種基因擴增結果用β-actin進行標化。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

檢測干預實驗（1）、（2）、（3）中脂聯(lián)素釋放。收集各組3T3-L1脂肪細胞的條件培養(yǎng)液。依據(jù)小鼠脂聯(lián)素ELISA試劑盒說明書分析脂聯(lián)素的濃度。每個濃度用標準曲線標化，并用相對未處理組百分數(shù)來表示。

1.6 提取細胞核并測定PPAR-γDNA結合活性

將干預實驗⑷各組3T3-L1細胞顆粒懸于A緩沖液中（10 mmol/L Hepes，pH 7.9，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl和蛋白酶抑制劑的混合物）。測定PPAR-γ的活性，按照PPAR-γ轉錄因子測定試劑盒的說明書進行操作。

1.7 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS13.5軟件處理，所有實驗均重復3次，結果以±s表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和 post hoc Dunnett′s test，以 P﹤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對PPAR-γ在3T3-L1脂肪細胞中表達的影響

3T3-L1細胞系由成纖維細胞分化成脂肪細胞，分化10～12 d后>95%的細胞呈現(xiàn)出顯著的多囊泡脂質沉積（圖1）。脂肪分化的重要標志（成熟的脂肪細胞）是轉錄因子PPAR-γ，在成纖維細胞（0 d）中沒有轉錄因子表達，但是在分化步驟中開始增加［前脂肪細胞（2 d）、不成熟或者年輕的脂肪細胞（4～8 d）、成熟的脂肪細胞（12 d）］。白藜蘆醇增加PPAR-γ表達呈劑量依賴方式，與對照組比較，50 μmol/L白藜蘆醇處理組中PPAR-γmRNA水平增加近2倍（表1）。

2.2 白藜蘆醇對脂聯(lián)素在分化3T3-L1脂肪細胞中表達及分泌的影響

為探討白藜蘆醇對脂聯(lián)素表達及分泌的作用，用不同濃度白藜蘆醇處理完全分化的3T3-L1脂肪細胞24 h。與對照組比較，白藜蘆醇在濃度為10～50 μmol/L時，脂聯(lián)素mRNA的表達呈劑量依賴方式增加（P<0.05）；與此相平行，脂聯(lián)素的分泌釋放也呈現(xiàn)劑量依賴方式增加（表1）。

2.3 TNF-α對脂聯(lián)素在分化3T3-L1脂肪細胞中表達及釋放的影響

為了證實TNF-α對脂聯(lián)素mRNA表達及分泌的作用，不同濃度的重組鼠TNF-α作用于完全分化的3T3-L1脂肪細胞24 h。與對照組比較，從濃度2.5 ng/mL開始，脂聯(lián)素mRNA表達水平成劑量依賴效應增加（P<0.01）。與mRNA表達相平行，ELISA檢測結果顯示：TNF-α組中脂聯(lián)素分泌的減少也呈現(xiàn)劑量依賴方式（表2）。

2.4 白藜蘆醇對TNF-α抑制的脂聯(lián)素表達及分泌的影響

白藜蘆醇顯著拮抗TNF-α誘導的脂聯(lián)素分泌減低，與TNF-α組比較，白藜蘆醇+TNF-α組在白藜蘆醇濃度為20 μmol/L及50 μmol/L時脂聯(lián)素分泌顯著增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。與脂聯(lián)素的分泌模式相平行，在mRNA水平上，白藜蘆醇部分拮抗TNF-α介導的脂聯(lián)素表達抑制，見表3。這個結果提示白藜蘆醇對脂聯(lián)素分泌的作用源于脂聯(lián)素表達的調節(jié)。另外，盡管白藜蘆醇的拮抗作用呈劑量依賴方式，但是最大的抑制效應也是部分的。

2.5 白藜蘆醇對TNF-α誘導PPAR-γmRNA表達及活性抑制的影響

為了明確白藜蘆醇的調節(jié)作用是否通過PPAR-γ介導，我們測定3T3-L1脂肪細胞細胞核提取物中PPAR-γDNA結合活性。結果顯示：TNF-α顯著抑制PPAR-γ活性，白藜蘆醇拮抗TNF-α抑制PPAR-γ DNA的結合活性（P<0.01）。用實時定量PCR法檢測白藜蘆醇對PPAR-γmRNA表達的作用，得到相似的結果，白藜蘆醇拮抗TNF-α介導的PPAR-γ mRNA抑制（P<0.01），見表4。

3 討論

胰島素抵抗與代謝綜合征（包括2型糖尿病和肥胖）密切相關。胰島素抵抗的患者及動物模型中，脂聯(lián)素血漿濃度和mRNA表達是下降的［7］。脂聯(lián)素生成調控的分子機制尚不十分明確。有報道證實，脂肪細胞中影響胰島素敏感性的一些激素和細胞因子對脂聯(lián)素表達和分泌有正面或者負面的影響。例如，噻唑烷二酮是PPAR-γ激動劑，可以增加脂肪細胞中脂聯(lián)素基因的表達以及循環(huán)中脂聯(lián)素的水平［8］。相反，另外一種可以誘導胰島素抵抗的細胞因子——TNF-α，作為脂聯(lián)素主要的負性調節(jié)劑導致代謝紊亂［9］。脂聯(lián)素和TNF-α在脂肪細胞中呈負相關表達，在胰島素抵抗的調節(jié)上起著相反的作用［1，4，5］。由于脂聯(lián)素對胰島素相關的代謝性疾病的保護性作用，TNF-α誘導脂聯(lián)素表達減少可能是胰島素抵抗進展的主要事件。

白藜蘆醇是一種自然存在的多酚，在紅酒、藍莓和花生中的含量較高。盡管已有報道證實白藜蘆醇有許多有益的作用，但對于脂聯(lián)素的調節(jié)機制尚不明確。本研究證實白藜蘆醇增加脂聯(lián)素在分化的3T3-L1脂肪細胞中的表達及分泌；這與陳思凡等［10］報道的無論胰島素存在與否，白藜蘆醇都可使胰島素抵抗狀態(tài)下的3T3-L1脂肪細胞脂聯(lián)素的mRNA表達增加，提示白藜蘆醇可能通過增加脂聯(lián)素的表達水平來改善胰島素抵抗相一致。但也有報道［11］證實白藜蘆醇抑制脂連素mRNA的表達，在抑制脂肪細胞分化方面，添加不同劑量的白藜蘆醇可明顯抑制細胞的分化，減少脂肪的蓄積。導致兩種不同結論的原因可能與脂肪細胞分化程度不同有關。本研究證實白藜蘆醇增加脂聯(lián)素在分化的3T3-L1脂肪細胞中表達及分泌的機制是白藜蘆醇增加PPAR-γ在3T3-L1脂肪細胞中的表達；并能有效抑制TNF-α誘導脂聯(lián)素分泌的下降，脂聯(lián)素mRNA的表達與白藜蘆醇誘導脂聯(lián)素的分泌呈平行變化；白藜蘆醇通過調節(jié)PPAR-γ活性拮抗TNF-α誘導下調脂聯(lián)素分泌及mRNA表達。有文獻報道［12］在高脂飲食誘導肥胖小鼠模型中證實PPAR-γ激動劑通過調控脂肪細胞分泌的脂肪細胞因子脂聯(lián)素的表達，改善胰島素抵抗，但調節(jié)機制沒有闡明。本研究可以部分證明白藜蘆醇增加脂連素的表達是通過增加PPAR-γ活性拮抗TNF-α對脂聯(lián)素分泌及mRNA表達的抑制作用來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究提示白藜蘆醇能夠通過調節(jié)PPAR-γ的轉錄活性繼而拮抗TNF-α誘導下調3T3-L1脂肪細胞中脂聯(lián)素的表達及分泌，這一結果將有助于設計新的治療藥物或治療方法，促進胰島素抵抗及2型糖尿病治療手段的發(fā)展。

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