郝祥俊，于曉敏，宋成軍，王小杰，陳志宏

（承德醫(yī)學(xué)院1.人體解剖學(xué)教研室；2.教務(wù)處；3.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，河北 承德06 7000）

細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）家族的一個亞族，可被多種生長因子和細(xì)胞因子激活，介導(dǎo)細(xì)胞的生長、增殖和分化等。已有研究發(fā)現(xiàn)［1，2］，無論是糖尿病模型大鼠還是糖尿病患者，腎臟ERK蛋白的含量及活性均明顯升高；同時(shí)，腎臟細(xì)胞增生、肥大，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）增多等糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）的典型病理改變與ERK信號通路的激活密切相關(guān)。

目前，隨著糖尿病發(fā)病率的迅速上升，DN的發(fā)病率也逐漸升高。臨床上主要用西藥治療糖尿病及其并發(fā)癥，但西藥的不良反應(yīng)不容忽視。絲膠是蠶繭中具有多種生物活性的天然蛋白質(zhì)，民間有蠶繭泡水降血糖的驗(yàn)方，本課題組的前期工作［3］已經(jīng)證明，絲膠可降低糖尿病模型大鼠的血糖，保護(hù)糖尿病導(dǎo)致的生殖功能障礙。本研究旨在探討絲膠對糖尿病模型大鼠腎臟ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響及可能機(jī)制，以期為臨床治療DN提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物分組及處理

48只雄性清潔級SD大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)部提供（合格證號712024），體質(zhì)量200～250 g。隨機(jī)選取12只作為正常對照組，不作任何處理；余下的36只建立2型糖尿病大鼠模型：2%鏈脲佐菌素（25 mg/kg）連續(xù)腹腔注射3 d，成模標(biāo)準(zhǔn)為注射鏈脲佐菌素1周后空腹血糖≥16.7 mmol/L［4］。模型成功建立后36只大鼠隨機(jī)均分為糖尿病模型組、絲膠治療組和二甲雙胍組，糖尿病模型組大鼠不再作任何處理，絲膠治療組大鼠灌胃給予絲膠（2.4 g·kg-1·d-1）35 d，二甲雙胍組大鼠灌胃給予二甲雙胍（55.33 mg·kg-1·d-1）35 d。

1.2 藥物與試劑

絲膠由彩色蠶繭（由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供）經(jīng)浸泡、水煎、過濾、濃縮而成；鹽酸二甲雙胍（國藥準(zhǔn)字H21024375，遼寧一成藥業(yè)有限公司）臨用時(shí)用蒸餾水配成溶液。鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）用枸櫞酸鈉—枸櫞酸緩沖液（pH=4.4）配成2%的溶液。檢測血糖試劑盒（保定長城臨床試劑有限公司）、BCA蛋白定量試劑盒（北京泰格美科技有限公司），兔抗pERK1/2抗體、兔抗絲裂原活化蛋白激酶的激酶（mitogen-activated protein kinase kinase，MEK）1/2抗體、兔抗c-fos抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司），小鼠抗β-actin單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）、山羊抗兔、小鼠IgG（美國KPL公司），ERK、MEK、c-fos引物由上海生工生物工程有限公司合成，Trizol（美國Invitrogen公司）、一步法RT-PCR試劑盒（大連寶生物工程有限公司）。

1.3 檢測血液指標(biāo)

4%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，經(jīng)內(nèi)眥于眶后靜脈叢采血后離心（3000 r/min，20 min），取血清-20℃保存。采用葡萄糖氧化酶法、使用Boehr inger Mannhe in/Hitachi 717全自動臨床生化分析儀檢測血糖。

1.4 腎臟ERK信號通路相關(guān)因子表達(dá)的檢測

大鼠取血后斷頭處死，取腎臟入液氮保存。

1.4.1 Western blot法檢測各組大鼠腎臟 ERK、MEK、c-Fos蛋白的表達(dá)：取液氮保存腎臟100 mg提取蛋白，加入蛋白裂解液冰上裂解腎臟組織，BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度。蛋白上樣量80 μg，15%SDS-PAGE凝膠電泳、PDVF膜轉(zhuǎn)膜；封閉后加入一抗［β-actin（1∶1000）、MEK1/2（1∶100）、pERK1/2（1∶100）、c-fos（1∶100）］，4 ℃孵育過夜；加入 HRP標(biāo)記的二抗（1∶5000），室溫?fù)u床孵育1 h，Super ECL Plus超敏發(fā)光液顯影。采用Quantity One-4.6.2軟件分析膠片掃描后的顯影條帶，以目的條帶和βactin條帶的灰度比值作為ERK、MEK、c-Fos蛋白的相對表達(dá)水平。

1.4.2 RT-PCR法檢測各組大鼠腎臟ERK、MEK、cfosmRNA的表達(dá)：取液氮保存腎臟（100 mg），按Trizol試劑說明提取腎臟的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，產(chǎn)物進(jìn)行PCR。PCR引物序列、擴(kuò)增條件及產(chǎn)物長度見表1。PCR反應(yīng)體系50 μL，PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，50～65℃退火30 s，72℃延伸1 min，第2步起循環(huán)。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物及5 μL的DNA Ladder行2%瓊脂糖凝膠電泳（90 V，40 min），ZF 型紫外透射反射分析儀攝像，Quantity One-4.6.2軟件進(jìn)行分析，以目的條帶和β-actin條帶吸光度的比值，作為ERK、MEK、c-fosmRNA的相對表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠的血糖結(jié)果

與正常對照組大鼠血糖［（10.83±2.03）mmol·L-1］比較，糖尿病模型大鼠的血糖［（29.45±4.82）mmol·L-1］明顯升高（P＜0.01）；與糖尿病模型組大鼠比較，絲膠治療組 ［（13.20±4.09）mmol·L-1］、二甲雙胍組［（13.18±2.30）mmol·L-1］大鼠的血糖明顯降低（P ＜0.01）。

2.2 各組大鼠腎臟ERK的表達(dá)

如圖1、表2所示，糖尿病模型組大鼠腎臟pERK蛋白及mRNA的表達(dá)較正常對照組大鼠高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟ERK的表達(dá)，絲膠治療組、二甲雙胍組大鼠腎臟pERK蛋白及mRNA的表達(dá)明顯較糖尿病模型組大鼠低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠腎臟MEK的表達(dá)

糖尿病模型組大鼠腎臟MEK蛋白及mRNA的表達(dá)較正常對照組大鼠高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟MEK的表達(dá)，絲膠治療組與二甲雙胍組大鼠腎臟MEK蛋白及mRNA的表達(dá)較糖尿病模型組大鼠低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖2和表3。

2.3 各組大鼠腎臟c-fos的表達(dá)

糖尿病模型組大鼠腎臟c-fos蛋白及mRNA的表達(dá)較正常對照組大鼠高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；絲膠、二甲雙胍均可明顯降低糖尿病模型大鼠腎臟c-fos的表達(dá)，絲膠治療組、二甲雙胍組大鼠腎臟c-fos蛋白及mRNA的表達(dá)較糖尿病模型組大鼠低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見圖3和表4。

3 討論

腎小球系膜增殖是DN早期的病理特征之一，也是晚期腎臟硬化的前驅(qū)表現(xiàn)之一［5，6］。DN時(shí)，腎小球系膜細(xì)胞是多種致病因子作用的主要靶細(xì)胞，同時(shí)系膜細(xì)胞又可合成和分泌多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子又在DN的進(jìn)展中發(fā)揮了重要作用［7，8］。細(xì)胞因子對細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)與細(xì)胞內(nèi)多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化密切相關(guān)，其中，ERK信號通路是糖尿病發(fā)病過程中不同信號通路的交匯點(diǎn)［9］。

本研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病模型大鼠腎臟ERK及其上游基因MEK1/2、下游基因c-fos的表達(dá)均明顯上調(diào)，ERK信號通路處于活化狀態(tài)。高血糖、腎素—血管緊張素系統(tǒng)激活、系膜細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物增多、血流動力學(xué)異常、內(nèi)皮素、轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）及血小板衍生生長因子等均可使ERK信號通路活化［10，11］。高血糖激活ERK通路可能與高糖的直接作用或高糖通過促進(jìn)非酶促糖基化反應(yīng)、多元醇代謝通路活化和氧化應(yīng)激加強(qiáng)等有關(guān)。Tian等［12］的研究發(fā)現(xiàn)，增高的血糖可經(jīng)糖酵解途徑使二脂酰甘油合成增加，從而激活蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）；PKC 作為 Raf/MEK/ERK通路的上游激酶，導(dǎo)致ERK活化。因此，糖尿病時(shí)ERK通路激活被認(rèn)為是DN發(fā)生發(fā)展過程中一個重要的分子機(jī)制，但具體的激活機(jī)制尚不完全清楚［9］。

ECM積聚是DN的一個顯著特征。ERK信號通路活化后可激活下游多種轉(zhuǎn)錄因子，通過促進(jìn)系膜基質(zhì)增生參與ECM的積聚，從而促進(jìn)DN的發(fā)生發(fā)展［13］。如 ERK 通路活化后通過激活 TGF-β1、磷酸化絲氨酸178位點(diǎn)使p27活化（Kip1）、增加c-fos和c-jun等基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞增殖、肥大，ECM合成增加、降解減少，導(dǎo)致ECM的進(jìn)行性積聚［14，15］；另外，TGF-β1等細(xì)胞因子還可間接激活ERK 信號通路，從而形成惡性循環(huán)［1，2］。

糖尿病屬中醫(yī)學(xué)“消渴癥”的范疇，治療原則是生精清熱、潤燥養(yǎng)陰。蠶繭是蠶蛾科昆蟲家蠶蛾的繭殼，性甘、溫，無毒，可滋陰潤燥、生精止渴，主治多飲、不生肌肉、腎消白濁和上中二消。起源于中國的蠶絲業(yè)擁有幾千年的悠久歷史，但對蠶絲的應(yīng)用主要集中于絲素，約占繭絲30%的絲膠遭到丟棄。學(xué)者們一直在探討如何有效利用如此大量優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)，并發(fā)現(xiàn)了絲膠許多新的功效，如美容、護(hù)膚、營養(yǎng)、抗氧化、抗癌等［16，17］。民間早有蠶繭泡水控制血糖的驗(yàn)方，本課題組的前期研究也證實(shí)了這一點(diǎn)［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，絲膠治療組大鼠腎臟MEK、ERK1/2及c-fos的表達(dá)明顯低于糖尿病模型組大鼠，表明絲膠可通過下調(diào)ERK及其上游、下游基因的表達(dá)，抑制ERK信號通路的激活，減輕ERK信號通路介導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增生肥大，ECM合成增加、ECM進(jìn)行性積聚以及細(xì)胞增殖等腎臟損傷，具有阻止糖尿病時(shí)腎臟損害的作用。同時(shí)，由于絲膠是天然的蛋白質(zhì)，具有生物相容性，可生物降解，對人體無毒性，可避免化學(xué)合成藥物帶給人體的不良反應(yīng)，因此具有良好的應(yīng)用推廣前景，但相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究與探討。

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