李丹，初陽，劉雅茹，張歧山，秦勇

（1.中國醫(yī)科大學藥學院生物制藥教研室，沈陽110001；2.中國醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院藥學部，沈陽110001；3.沈陽軍區(qū)總醫(yī)院醫(yī)學情報科，沈陽1108 40）

苯是環(huán)境污染物中廣泛存在的一種致癌物質(zhì)，可引起非淋巴細胞性白血病等血液疾病，低劑量的苯還能引起白細胞及血小板減少［1］。苯的毒性大部分來源于它的代謝產(chǎn)物。苯代謝產(chǎn)物主要通過2種途徑產(chǎn)生：一種是通過對苯環(huán)的修飾，如苯甲醛和對苯醌，一種是通過開環(huán)反應，如反向，反向-2，4-二烯-1，6-己二酮（trans，trans-muconaldehyde，MUC）［2］。這2種代謝途徑都能產(chǎn)生具有毒性和致畸性的產(chǎn)物，能導致骨髓細胞形成微核，能與DNA、蛋白質(zhì)直接反應形成復合物，導致細胞損害［3～5］。目前關(guān)于苯的代謝途徑及調(diào)控回路尚未完全清楚［6］。結(jié)合多個苯代謝產(chǎn)物具有羥基的結(jié)構(gòu)特征，本研究擬探索醛酮還原酶（aldo-keto reductase，AKR）在苯代謝途徑中的潛在作用。AKR是一類針對羰基化合物的NADPH依賴型氧化還原酶，廣泛存在于細菌、酵母、哺乳動物中［7］，能催化還原一系列自然界存在的或合成的醛酮化合物為毒性較小或無毒性的相應的醇［8］。人源AKR7A2最早在腦中發(fā)現(xiàn)，是琥珀半醛還原酶，能還原琥珀半醛為γ-羥基丁酸甲酯［9］。后期研究發(fā)現(xiàn)，AKR7A2還分布于肝和腎等多種組織［10］，而且對多種醛或酮有催化活性，對具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)或雙羥基結(jié)構(gòu)的醛或酮也具有一定催化活性［10，11］。本研究擬使用快速蛋白液相層析（fast protein liquid chromatography，F(xiàn)PLC）系統(tǒng)采用兩步純化法純化重組AKR7A2融合蛋白，并通過酶活性實驗檢測AKR7A2重組蛋白對苯代謝產(chǎn)物的底物特異性，為進一步探索苯及其代謝產(chǎn)物的代謝途徑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21購自Novagen公司；ECL試劑盒購自PIERCE公司；蛋白分子量標準購自NEB公司；5 mL HiTrap親和柱購自GE公司；NADPH、苯甲醛、對苯醌、MUC及IPTG購自Sigma公司；AKR7A2的重組質(zhì)粒pLI19和兔抗AKR7A2多克隆抗體由英國University of Strathclyde的Elizabeth Ellis博士惠贈［9］；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和誘導表達：將質(zhì)粒pLI19轉(zhuǎn)化至BL21細菌感受態(tài)，涂布于含氨芐霉素和氯霉素的LB瓊脂平板，37℃培養(yǎng)過夜。挑取轉(zhuǎn)化后單菌落接種到培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜后，將菌液按1︰50接種到500mL培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至A600約為0.6時加入IPTG，37℃誘導培養(yǎng)約2 h。收集菌液，并取少量菌液加入1×SDS loading buffer中，100℃加熱5 min，取上清進行100 g/L的SDS-PAGE電泳。聚丙烯凝膠考馬斯亮藍染色，脫色后觀察誘導蛋白表達。

1.2.2 使用FPLC系統(tǒng)純化AKR7A2融合蛋白：挑取轉(zhuǎn)化后的菌落，經(jīng)誘導培養(yǎng)后收集菌體，加入溶解緩沖液充分重懸菌體，超聲破碎2 min，冰浴20 min；4℃，12000 r/min離心20 min后收集上清液。融合蛋白的純化使用Pharmacia公司的FPLC系統(tǒng)。將上清液稀釋到50 mL，加入HiTrap親和柱中，用50 mL Start buffer清洗，經(jīng)梯度洗脫后，收集洗脫液。將HiTrap柱的洗脫液加入到G25 Sephadex凝膠柱中，經(jīng)Desalt buffer洗脫后，收集洗脫液。從2次洗脫液中分別取10 μL純化的蛋白，加入2×SDS loading buffer，100℃加熱5 min，行SDS-PAGE電泳。聚丙烯凝膠考馬斯亮藍染色，脫色后觀察重組蛋白的純化。

1.2.3 Western blot：將純化后的蛋白經(jīng)100 g/L的SDS-PAGE凝膠分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉常溫封閉1 h，TBST洗膜15 min×4次。加入兔抗 AKR7A2抗體（1︰2000），4℃過夜，TBST洗膜15 min×4 次。加 HRP-羊抗兔 IgG（1︰10000），室溫1 h，TBST洗15 min×4次。ECL顯色曝光。

1.2.4 AKR酶活性實驗檢測AKR7A2對苯代謝產(chǎn)物的底物特異性：使用Beckman公司的DU650分光光度計進行AKR7A2的底物催化活性測定。反應在25℃進行，測量反應混合液在340 nm的光吸收值，反應混合液1mL中含100mol/L磷酸鈉溶液（pH6.8），0.05 mol/L NADPH，約10 μg純化蛋白和反應底物。以無純化蛋白的反應混合液做空白對照，結(jié)果表達為 nmol·min－1·mg－1。AKR7A2 的特異性底物琥珀半醛、鄰羧基苯甲醛和9，10-菲醌做陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 AKR7A2融合蛋白的誘導表達及純化

將重組質(zhì)粒pLI19轉(zhuǎn)化至BL21表達菌中，經(jīng)IPTG37℃誘導2 h，取少量菌液經(jīng)SDS-PAGE分析，可見誘導表達的蛋白在36 kDa處呈現(xiàn)明顯的條帶（圖1C）。誘導后的菌體經(jīng)超聲裂解，離心，收集上清液。使用FPLC系統(tǒng)通過HiTrap親和柱（圖1A）及G25 Sephadex凝膠柱（圖1B） 對 His標簽的AKR7A2融合蛋白進行純化，SDS-PAGE分析純化后的蛋白可見單一的條帶（圖1C），表明重組AKR7A2蛋白被成功誘導表達并純化獲得高純度的單一蛋白。

2.2 融合蛋白的鑒定

Western blot分析純化后的蛋白，結(jié)果顯示：兩步純化后的AKR7A2融合蛋白能被兔抗AKR7A2多克隆抗體特異性識別（圖2），表明AKR7A2融合蛋白被成功純化。

2.3 AKR酶活性實驗結(jié)果

結(jié)果顯示：AKR7A2重組蛋白對苯甲醛的底物特異性為（62±5）nmol·min－1·mg－1，表現(xiàn)為中等親和力；對MUC的底物特異性為（149±8）nmol·min－1·mg－1，表現(xiàn)為較高的親和力；對對苯醌的親和力較低，底物特異性為（26±3.2）nmol·min－1·mg－1（表1）。

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)人體表達的AKR共有13個，其中AKR7A亞族有2個人源成員AKR7A2和AKR7A3［7］。AKR7A2作為腦中琥珀半醛還原酶的功能已有較多研究，最新研究發(fā)現(xiàn)AKR7A2還能保護細胞免受多個有毒醛或酮的毒害，是體內(nèi)重要的保護酶之一［11，12］。AKR7A2成員對具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)或雙羥基結(jié)構(gòu)的醛或酮也具有一定催化活性［10］，表明其有可能參與具有此結(jié)構(gòu)特點的苯代謝產(chǎn)物的代謝。

本研究在BL21大腸桿菌中誘導表達His標簽的AKR7A2融合蛋白，對His-AKR7A2融合蛋白的純化方法進行優(yōu)化，采用FPLC系統(tǒng)經(jīng)HiTrap親和柱和G25 Sephadex凝膠柱體外純化His-AKR7A2蛋白。通過SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western blot驗證了純化后的AKR7A2重組蛋白。AKR酶活性實驗檢測純化的AKR7A2重組蛋白對苯代謝產(chǎn)物苯甲醛、MUC和對苯醌的底物特異性，結(jié)果顯示：AKR7A2對苯甲醛有中等親和力，對MUC有較高的親和力，但對對苯醌的親和力較低。本研究結(jié)果表明，AKR對苯代謝產(chǎn)物有一定的催化活性，很可能參與苯的中間代謝產(chǎn)物的代謝，為探索苯的體內(nèi)代謝途徑提供了新思路。

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