鄢 進 （武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430071；復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院，上海200433）

陳金中，王臻臻，夏 鵬 （復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)院，上海200433）

黎七雄 （武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢430071）

蛋白酶體能抑制細胞凋亡，而蛋白酶體抑制劑MG132誘導(dǎo)人血管內(nèi)皮細胞凋亡［1－3］。PSMA3基因在Bim凋亡調(diào)節(jié)蛋白起什么作用，有何影響，目前尚未見文獻報道。因此，本研究的主要目的是探究PSMA3基因在Bim蛋白中的調(diào)節(jié)作用，研究PSMA3調(diào)節(jié)Bim蛋白對細胞凋亡的影響，闡明蛋白酶體與細胞凋亡的關(guān)系，為研究蛋白酶體抑制劑有效的刺激或誘導(dǎo)細胞Bim的表達水平上調(diào)，為疾病的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要藥品及試劑 QIAquick的膠回收試劑盒，由德國的Qiagen公司提供；QIAquiekPCR的純化試劑盒，由德國的Qiagen公司提供；硝基纖維素膜 （Hybond－C），由美國Amersham Pharmacia Biotech公司提供；常規(guī)質(zhì)粒的快速提取的試劑盒，由北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司提供；DNA片段／PCR產(chǎn)物的快速純化以及回收試劑盒，由北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

使用的電泳各項試劑均系Bio－Rad產(chǎn)品；純化蛋白使用的瓊脂糖凝膠珠Ni－NTTA由Novegen公司提供；DNA與蛋白Markers由New England Biolabs公司提供；各種內(nèi)切酶如EeoRI、BamHI、Xhol、Hindlll等，T4DNA的連接酶，由英國Biolab公司提供；過硫酸胺，由美國Sigma公司提供；考馬斯亮藍的R250／G250，由美國AMRESCO公司提供；兔抗人的bimL的多克隆抗體，由美國Santa Cruz公司提供；兔抗人的PSMA3的多克隆抗體，由美國Santa Cruz公司提供；分析純，Tris堿，由美國Boehringer Mannheim公司提供；Dulbecco's modified Eagle's medium （DMEM）由美國 Gibco公司提供；其他的常用試劑是國產(chǎn)分析純試劑dNTPs，由上海生工生物工程公司提供。分子量蛋白標(biāo)準，由中國科學(xué)院上海生化所提供；TaqDNA的聚合酶，由上海生工生物工程公司提供。以上所有的引物都是由上海賽百盛公司合成。

大腸桿菌的DH5菌株：基因型SupE44，pcDNA3.0，由美國的Invitrogen公司提供；pcDNA4／myc－h(huán)is的系列，由美國的Invitrogen公司提供；綠熒光表達的載體pEGFP－Cl，由美國的Clonteeh公司提供；真核表達的載體pcDNA系列，由美國的Invitrogen公司提供；紅熒光表達的載體pDsRedl－N1，由美國的Clonteeh公司提供；HEK293、PSMA3及BIM由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)國家重點實驗室提供。

1.1.2 主要儀器 哈爾濱 HZQ－C搖床，德國 Mastercyclergradien Eppendorf PCR儀，日本Olympus顯微鏡，上海 HHS－U99水浴鍋，日本 Hitachi 20PR－52D離心機，美國550Bio－Rad酶標(biāo)儀，德國Eppendorf 5415DEppendorf臺式離心機，上海SDJ超凈工作臺，美國Power3000Xi Bio－Rad蛋白電泳儀，美國Mini－100Bio－Rad蛋白電泳槽。生物電泳凝膠成像及掃描分析軟件：Smart View3.0.Origin Pro6.0software.Annutating Grabber－1T2.51及 UVP Gelworks ID Advanced Version。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 在37℃，5%CO2的環(huán)境下用培養(yǎng)皿，將10%胎牛血清加入到含雙抗的DMEM的培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)293T細胞。

1.2.2 真核表達載體的構(gòu)建 PSMA3的基因首先設(shè)計特異引物通過PCR擴增，再將PCR的產(chǎn)物純化，經(jīng)過雙酶切，包括真核表達的載體也要進行雙酶切，酶切以后通過連接轉(zhuǎn)化，再做陽性克隆鑒定，最后送公司進行測序和分析［4］。

1.2.3 質(zhì)粒的小量提取 對篩選的單克隆菌落的小瓶培養(yǎng)菌液，吸取1.5ml菌液，放在Ep管中，12000g，離心2min，取菌體沉淀。加入SolutionⅠ100μl，用移液器吹打沉淀，直到打散為止。加入SolutionⅡ200μl，輕混搖勻，冰浴5min。加入SolutionⅢ150μl，振蕩混勻，冰浴5min。12000g，離心2min，吸取400μl上清液，轉(zhuǎn)移在新的Ep管中，加880μl無水乙醇，混勻室溫放5～30min。12000g，離心2～5min，棄去上清液，用70%的乙醇清洗得到的DNA，棄上清，室溫干燥后，加入TE緩沖液溶解20μl，4℃保存。

1.2.4 其他 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染、亞細胞定位、細胞蛋白抽提、Western blot檢測和免疫共沉淀方法均按文獻 ［4］操作。

2 結(jié) 果

2.1 應(yīng)用PlexA－bimL技術(shù)從人胎腦PB42AD文庫篩選PSMA3

常見的3個Bim異構(gòu)體：Bim S／L／EL，三者的促凋亡作用依次減弱，在細胞內(nèi)Bim主要是以BimL／EL的形式存在。我們在研究過程中選用促凋亡效應(yīng)中等的Bim L來進行研究。從人胎腦pB42AD文庫中篩選到121個陽性克隆，其中陽性克隆出現(xiàn)超過一次以上的基因有下列11個，經(jīng)過測序驗證，和Blastn基因庫數(shù)據(jù)比對發(fā)現(xiàn)，它們所代表的基因分別為：MIF、PMSB4，GRB10、PMSA3、 Ferritin Heavy Chain、 TUBB5、 CTBP2、 CGI99、 SART3、S100、LOC199990（見表1）。

表1 人胎腦PB42AD文庫篩選PSMA3結(jié)果

我們對其中的NM－002788所代表的人蛋白酶體亞基產(chǎn)生了濃厚的興趣。此基因位于1q21，mRNA為1014bp，含有7個外顯子，編碼的蛋白是30KD大小，且主要分布于細胞的胞核、胞漿中，主要執(zhí)行蘇氨酸內(nèi)肽酶的分子功能，在生命過程中參與泛素依賴性的蛋白分解代謝。

2.2 光共聚焦測定PSMA3和Bim胞質(zhì)的分布

用pEGFP－C1－BimL／pDsRed－PSMA3在HEK293T中過表達檢測亞細胞定位情況，如圖1所示，在同一視野不同的熒光下拍攝的照片，可以看出pEGFP－C1－BimL轉(zhuǎn)染效率要高于pDsRed－PSMA3。在共轉(zhuǎn)染的細胞中，熒光顯示Bim在細胞胞質(zhì)中分布，而PSMA3則是顆粒狀的分布在細胞胞質(zhì)中，融合蛋白主要分布在細胞核核膜的周圍。熒光共聚焦實驗提示，PSMA3和Bim在細胞內(nèi)的空間上存在相互作用可能性。

圖1 熒光共聚焦測定PSMA3和Bim胞質(zhì)的分布

2.3 PSMA3對Bim蛋白表達的影響

實驗組將質(zhì)粒PEGFP－BimL／pCMV－MYC－PSMA3共轉(zhuǎn)入 HEK293T細胞，對照組共轉(zhuǎn)pEGFp－BimL／pCMV－MYC，proteinA／G用兔抗pEGFP抗體孵育，免疫沉淀pEGFP－BimL，用鼠抗MYc抗體檢測MYc－PSMA3。PSMA3能增加HEK293t細胞胞質(zhì)中Bim L的表達，同時，胞內(nèi)過表達的Bim L能與過表達的PSMA3也存在相互作用。

3 討 論

細胞凋亡是一種進化保守的細胞死亡形式，不僅在正常的生理狀態(tài)具有重要作用，而且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近年來研究認為，細胞凋亡異常可能與腫瘤發(fā)生有關(guān)。凋亡調(diào)控基因已被看作是一類新的腫瘤發(fā)生相關(guān)基因。腫瘤的發(fā)生是由于細胞增殖與細胞凋亡之間的平衡失調(diào)的結(jié)果，細胞凋亡在腫瘤生長過程中起負調(diào)控作用，因此，研究抑制多種腫瘤細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡而對正常細胞影響不大是腫瘤治療的新思路［5－6］。

為了研究線粒體依賴性凋亡過程中Bim潛在的分子調(diào)節(jié)機制，通過篩選胎腦文庫，克隆到一個未曾報道過的并能與Bim相互作用的蛋白分子——人蛋白酶體α亞基3型 （PSMA3）。應(yīng)用顯微共聚焦和免疫共沉淀的技術(shù)，我們證實了PSMA3和Bim在細胞內(nèi)的分布，它們之間存在相互作用并可能具有功能上的聯(lián)系。在HEK293細胞內(nèi)，可檢測到內(nèi)源性的PSMA3和Bim的復(fù)合物，尤其是凋亡信號刺激下的細胞。我們在實驗中還發(fā)現(xiàn)，在HEK293亞細胞中顯示PSMA3和Bim共定位、共表達，PSMA3可以一定程度上增加Bim表達而誘導(dǎo)的細胞凋亡。隨著細胞凋亡機制的深入研究，人們對細胞凋亡機制的認識會更加深入。由于Bim的表達和調(diào)節(jié)具有細胞類型特異性，因而應(yīng)用有效的誘導(dǎo)腫瘤細胞中Bim的表達水平上調(diào)可為腫瘤的治療提供一個新的思路。

本研究初步發(fā)現(xiàn)，PSMA3對BIM介導(dǎo)的細胞凋亡具有一定的調(diào)節(jié)作用，這只是研究中的一點線索，PSMA3與Bim介導(dǎo)的細胞凋亡之間存在何種關(guān)系還需要進一步而大量的研究來探究。