王蘭萍，耿榮慶，王 偉，鄧喬文，徐永新，陳 鑰

(鹽城師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224051)

牛肉是廣受歡迎的肉類食品，也是我國人民消費的重要肉類食品之一。由于牛肉含有豐富的蛋白質(zhì)，脂肪含量低，氨基酸組成比豬肉更接近人體需要，且能提高機體抗病能力，許多消費者逐漸傾向于選擇牛肉，牛肉在肉類消費中所占的比重逐漸增加[1]。近年來，受牛肉消費需求急劇上升、飼養(yǎng)成本提高等多種因素影響，牛肉價格持續(xù)上漲[2-3]。牛肉消費還受到消費習(xí)慣、地域條件等方面的影響，導(dǎo)致來源于不同牛種的牛肉及肉制品價格差異明顯[4-5]。受經(jīng)濟利益的驅(qū)使，市場上經(jīng)常出現(xiàn)用價格相對較低的黃牛肉假冒價格較高的水牛肉和牦牛肉及其肉制品的現(xiàn)象。

為了保護消費者的利益和監(jiān)督牛肉產(chǎn)業(yè)鏈，尋求快捷、準確的方法對牛肉制品中牛源性成份進行鑒別十分必要。本研究擬運用PCR擴增，結(jié)合DNA測序技術(shù)，建立鑒別不同牛種來源牛肉的有效分子生物學(xué)方法。

1 材料與方法

1.1 牛肉樣本來源及處理

分別購買市售的生鮮黃牛肉、牦牛肉和水牛肉各20份。每份樣品分兩部分，一部分直接保存于-20 ℃，另一部分在沸水中將牛肉煮熟后保存于-20 ℃。

1.2 牛肉樣本總DNA提取

將冷凍的生牛肉和熟牛肉取出，每個樣本約取30 mg，采用離心柱式組織基因組DNA小量抽提試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取總DNA。提取的總DNA樣品溶于100 μL洗脫液TE中，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計、PCR擴增與檢測

根據(jù)Kocher等[6]設(shè)計的通用引物，進行優(yōu)化設(shè)計后用于擴增12SrRNA基因片段，一對上、下游引物序列分別為5′-AAACTGGGATTAGATACCCCACTAT-3′和5′-GAGGGTGACGGGCGGTGTGT-3′。

PCR擴增體系為25 μL，其中10× buffer 2.5 μL，25 mmol/L MgCl22 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL，10 pmol/L引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.3 μL，DNA模板100 ng。PCR擴增條件為：94℃ 3 min；94℃ 1 min，60 ℃ 1 min, 72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳上檢測。

1.4 PCR擴增產(chǎn)物的測序及數(shù)據(jù)分析

PCR擴增產(chǎn)物采用凝膠回收純化試劑盒(北京天根生化科技有限公司)純化后直接送南京金斯瑞生物科技有限公司進行正反雙向測序，結(jié)合觀察測序峰圖人工核對測序結(jié)果。

引用GenBank數(shù)據(jù)庫中已有的普通牛(GenBank序列號JN817322)、瘤牛(GenBank序列號DQ867006、AF492350)、牦牛(GenBank序列號AY684273、AF091686、EF494179、GQ464260、JQ846022)和水牛(GenBank序列號GU119956、HM623876、AF547270)的12SrRNA基因序列作為參照。采用Clustalx1.83[7]軟件對所有測序獲得的12SrRNA基因序列和引物序列進行多序列比對。在序列比對的基礎(chǔ)上，基于Kimura雙參數(shù)模型，運用MEGA5.1[8]軟件以鄰接法(Neighbor joining，NJ)構(gòu)建基因進化樹，進化樹各分支的置信度都采用1000次自展分析進行重復(fù)檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 12S rRNA基因片段的PCR擴增結(jié)果

一對引物在所有生牛肉DNA樣品和熟牛肉DNA樣品中均能擴增出一條明亮的特異性產(chǎn)物條帶(圖1)，而且所擴增的12S rDNA片段大小與預(yù)期相符，約為440 bp。該結(jié)果不僅驗證了所提取DNA模板質(zhì)量的有效性，也表明引物具有通用性，且無非特異性擴增，可用于后續(xù)測序分析。

圖1 12S rDNA基因擴增片段的電泳圖Fig. 1 Electrophoresis picture of amplification fragment of 12S rDNA gene

2.2 基于12S rDNA基因序列特征鑒別牛肉樣品的種源

分別將生黃牛肉、牦牛肉、水牛肉及相應(yīng)熟牛肉樣品的PCR擴增產(chǎn)物純化后測序，每個生牛肉與對應(yīng)的熟牛肉樣本的12S rDNA基因測序結(jié)果均相同。根據(jù)測序結(jié)果可知，擴增的牦牛、水牛12S rDNA基因片段大小都為440 bp，而黃牛12S rDNA基因片段大小都為439 bp；在黃牛、牦牛、水牛的樣本中，分別定義了1種(HN)、3種(MN-1、MN-2、MN-3)和2種(SN-1、SN-2)單倍型序列(圖2)。多序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃牛、牦牛、水牛12S rDNA基因不僅在片段長度上存在一定差異，而且在堿基序列上存在更為顯著的差異，顯示出明顯的種間特異性。牛種間12S rDNA基因序列差異百分比顯示，牦牛與水牛之間最大(約7.5%)，黃牛與水牛之間居中(約6.8%)，黃牛與牦牛之間最小(約3.2%)。

圖2 牛種間12S rDNA基因的多序列比對Fig. 2 Mutiple sequence alignment of 12S rDNA gene among bovine species

圖3 基于NJ 法構(gòu)建的12S rDNA基因進化樹Fig. 3 Gene evolutionary tree of the 12S rDNA gene constructed based on the NJ method

基于試驗獲得的3個牛種12S rDNA基因序列和引用的牛12S rDNA基因序列，構(gòu)建的系統(tǒng)進化關(guān)系如圖3所示。系統(tǒng)進化樹顯示，所有的黃牛、牦牛、水牛12S rDNA基因序列各自獨自聚為一類，本試驗測序獲得的黃牛、牦牛、水牛12S rDNA基因序列分別與引用的黃牛、牦牛、水牛12S rDNA基因序列聚類。由此可見，參照已知牛種12S rDNA基因序列，與測序獲得的牛種序列共同構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，能夠清晰地鑒別測序樣品的牛種來源。

3 討 論

鑒別肉類的種源特征在打擊摻假、保護消費者權(quán)益等方面具有十分重要的意義。用于肉類物種的鑒定主要有顯微觀察法、蛋白質(zhì)分析法和DNA檢測法等[9-10]。以DNA為基礎(chǔ)的檢測是一類簡便、準確、靈敏的方法，在實際應(yīng)用中最為廣泛，可分為核酸探針雜交、PCR-RFLP分析、DNA指紋分析、PCR特異擴增和熒光定量PCR等技術(shù)[11-12]。

線粒體DNA既具有一定的種間變異性，又具有高度的種內(nèi)保守性，是物種鑒定的理想遺傳標記。線粒體12SrRNA基因還同時具有抗腐蝕和耐高溫的特點，已經(jīng)成為肉類鑒別中的重要標記基因之一[13-15]。運用12SrRNA基因作為標記基因，基于PCR擴增方法進行肉類種源鑒別的常用方法主要有PCR-RFLP、PCR特異性片段擴增、實時熒光定量以及PCR產(chǎn)物直接測序法。PCR產(chǎn)物直接測序法可以使用通用引物擴增，不僅能夠獲得豐富的基因序列信息，而且無需其它復(fù)雜的后續(xù)分析，甚至能夠鑒定出親緣關(guān)系非常近的物種。本研究中，通過使用哺乳動物通用引物，首先分別擴增黃牛、牦牛和水牛的12SrRNA基因片段，然后引用已知物種相應(yīng)基因的序列作為參照，將直接測序獲得的各牛種基因序列進行聚類分析，就能夠很好地鑒定不同物種來源的牛肉，鑒定結(jié)果的準確率為100%。因此，結(jié)合運用PCR擴增和DNA測序技術(shù)是一種精確可靠的方法，能夠有效地運用于牛肉的種源鑒別。

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