張利亞，陳智華，鐘金城，姜雪鷗，李 娜

(西南民族大學 動物遺傳育種學國家民委-教育部重點實驗室，四川 成都610041)

牦牛是青藏高原高寒草地牧區(qū)畜牧業(yè)經(jīng)濟中不可缺少的重要畜種。然而牦牛的生產(chǎn)性能遠低于其他牛種，主要表現(xiàn)為生長速度慢，成熟期晚，產(chǎn)乳、產(chǎn)肉量低等。為了提高牦牛的生產(chǎn)性能，研究人員對牦牛和普通牛進行種間雜交，結(jié)果雜交一代犏牛產(chǎn)肉量、產(chǎn)奶量均有所提高，表現(xiàn)出顯著的雜種優(yōu)勢[1-2]。但由于犏牛雄性不育，限制了雜種優(yōu)勢和牦牛遺傳資源的充分利用。

犏牛雄性不育的最終表現(xiàn)是精子發(fā)生過程受阻，即公犏牛無法完成減數(shù)分裂過程導致不能產(chǎn)生精子。近年來的研究結(jié)果顯示，Y染色體特異基因在動物精子形成過程中起著重要作用[3-4]。TSPY基因是近年來發(fā)現(xiàn)的與精子發(fā)生相關(guān)的基因，由于該基因在人睪丸中特異性表達，將其命名為TSPY(testis-specific protein Y encoded)[5-6]。TSPY基因是一個多拷貝的重復基因，多數(shù)拷貝位于Yp11.2的4A區(qū)，少數(shù)位于Yq11.23，每個拷貝被插入到DYZ5的一個20 kb串聯(lián)重復基因簇中，Y染色體長臂和短臂上大小基因簇共存[7-8]。TSPY蛋白是 SET/NAP結(jié)構(gòu)域中的成員，SET/NAP結(jié)構(gòu)域參與細胞周期的調(diào)節(jié)和細胞分化[9-10]。在人體中，TSPY蛋白結(jié)合有絲分裂和減數(shù)分裂過程中的細胞周期蛋白B，提高活化的細胞周期蛋白B-CDK1 酶的活性，加快細胞周期G2/M期的轉(zhuǎn)換[11-14]，此外小鼠和人的TSPY蛋白可以結(jié)合精子細胞細胞質(zhì)中的組蛋白，作為組蛋白的分子伴侶，在精子發(fā)生過程中起著重要作用[15-16]。

Verkaar等[7]和宋大偉[18]克隆了牦牛TSPY基因的部分序列，但目前尚未見牦牛和犏牛TSPY基因編碼區(qū)全序列的相關(guān)報道。鑒于此，本試驗采用了PCR擴增、克隆測序獲得了牦牛、犏牛TSPY基因編碼區(qū)全序列，并利用生物信息學方法分析了TSPY基因的序列、結(jié)構(gòu)及與其他物種TSPY基因間的進化關(guān)系，以期為進一步研究TSPY基因的功能及其與犏牛雄性不育的關(guān)系提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及組織樣品采集

從四川省紅原縣龍日種畜場隨機選取健康成年牦牛7頭，采集耳組織，75%乙醇保存帶回實驗室，存于-20 ℃的冰箱中備用；從青海省河北鄉(xiāng)金科村選取健康犏牛7頭，采集睪丸組織，置于液氮中速凍，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑

基因組提取試劑盒、膠回收試劑盒購于AxyGENE 公司，2×Long Taq PCR MasterMix、DNA Marker 2000購自Tiangen公司，IPTG、X-gal、氨卞青霉素購自大連寶生物(TakaRa)工程有限公司。

1.3 菌株和質(zhì)粒載體

大腸桿菌E.coliDH5α購于Tiangen公司，pMD19-T克隆載體購自大連寶生物(TakaRa)工程有限公司。

1.4 基因組DNA的提取和檢測

采用動物組織基因組DNA提取試劑盒提取牦牛和犏牛基因組DNA。用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計雙重檢測 DNA的純度和濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 引物設(shè)計、合成

參考Genbank中公布的普通牛TSPY基因DNA序列(登錄號為AC_000165.1)，應用引物設(shè)計軟件primer premier 5.0設(shè)計兩對引物(表1)。

1.6 TSPY基因的PCR擴增

PCR反應在25 μL體系中進行：模板DNA 1 μL，上、下游引物(10 pmol· μL-1)各1 μL，2×Long Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。

引物1的PCR擴增按以下程序進行：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，64.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。引物2的PCR擴增按以下程序進行：95 ℃預變性4 min；95 ℃變性30 s，67 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min；4 ℃保存。產(chǎn)物均用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7 擴增產(chǎn)物的克隆與測序

對牦牛和犏牛TSPY基因PCR產(chǎn)物進行膠回收純化，回收的目的片段與 pMD19-T載體于16 ℃恒溫金屬浴中反應連接4 h；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)宿主菌中培養(yǎng)；再將菌液涂布在含有X-Gal底物、IPTG誘導物和芐青霉素(Amp )的固體LB平板上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h；利用藍白斑遺傳學篩選法篩選；挑取白色單一菌落，接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。對鑒定為陽性的克隆進行測序，測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

表1 TSPY基因擴增引物及擴增范圍Table 1 Primers and the respective size of amplified DNA fragment of the TSPY gene

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用DNAMAN 軟件對犏牛、牦牛和普通牛的TSPY基因序列進行比對，在線生物軟件CpG Island Searcher(http://www.cpgislands.com/)預測CpG島，核苷酸序列的翻譯使用在線物包(http://www.bio-soft.net/sms/)，ExPASy Proteomics Server ( http://web.expasy.org/pr- otparam/ ) 在線軟件預測氨基酸的理化性質(zhì)(氨基酸的組成、相對分子生量、理論等電點、蛋白質(zhì)的親疏水性及穩(wěn)定性等)，SignalP4.0 程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析可能的信號肽，TMpred Server軟件(http://ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)對蛋白進行跨膜螺旋區(qū)預測，NCBI conserved domains(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/ cdd/wrpsb.cgi)在線軟件分析TSPY蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位預測使用PSORTII(http://psort.nibb.ac.jp/)，PBIL NPS@(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)預測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牦牛和犏牛TSPY基因的擴增、測序與分析

1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測發(fā)現(xiàn)引物1和2擴增效果良好(圖1和圖2)，克隆測序后，1號擴增片段長度為1 098 bp，2號擴增長度為1 024 bp，與預期結(jié)果一致。對序列進行拼接，得到長度為954 bp的編碼區(qū)序列，此序列包含6個外顯子。DNAMAN比對發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛TSPY基因序列的一致性分別為98.95%，犏牛與牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分別為98.95%、99.79%(核酸序列差異性如圖2所示)，而牦牛、犏牛與人、大鼠的相應序列一致性都僅在50%左右，說明TSPY基因在不同物種之間同源性較低，這與Xue[19]的研究結(jié)果相一致。

通過CpG島在線分析軟件搜索發(fā)現(xiàn)，牦牛和犏牛TSPY基因編碼區(qū)序列有 1 個 CpG 島，包含全部擴增序列1-951，長度為951 bp(圖3和圖4)。堿基組成分析發(fā)現(xiàn)，CpG 島序列的GC含量分別為58.6%、60.5%，差異主要體現(xiàn)在第二個外顯子的CpG 位點上。

2.2 TSPY蛋白的氨基酸序列分析與結(jié)構(gòu)預測

圖1牦牛和犏牛TSPY基因的RT-PCR電泳圖
M.DNA分子量標記；1.引物1 PCR 產(chǎn)物；2.引物2 PCR產(chǎn)物
Fig.1 RT-PCR of TSPY in yak and cattle-yak
M.DNA molecular weight marker;1.PCR product of primer 1;2.PCR product of primer 2

圖2 牦牛和犏牛TSPY基因 CpG 島的預測豎線表示 CpG 位點，下劃線表示為 CpG 島Fig. 2 The result of searching for CpG island of yak and cattle-yak TSPY gene Vertical lines stand for CpG site, underline stands for CpG island

2.2.1 序列分析 牦牛和犏牛TSPY基因均編碼含有317個氨基酸殘基的TSPY蛋白，使用EMBL-EBI在線比對工具發(fā)現(xiàn)牦牛與普通牛TSPY氨基酸序列的一致性為98%，犏牛與牦牛、普通牛TSPY氨基酸一致性分別為98%、99%。結(jié)合表2和表3，犏牛TSPY基因與牦牛和普通牛相比，第113位核酸發(fā)生了改變(T→C)，導致第38位氨基酸發(fā)生變化(V→V→A)。

表2 牦牛、普通牛和犏牛TSPY核酸序列的差異性分析Table 2 Difference analysis of nucleonic acid sequences of TSPY from yak,bovine and cattle-yak

表3 牦牛、普通牛和犏牛TSPY氨基酸序列的差異性分析Table 3 Difference analysis of amino acid sequences of TSPY from yak,Bos Taurus and cattle-yak

2.2.2 理化性質(zhì)分析 預測牦牛和犏牛的相對分子量分別為36 504 kDa、36 454 kDa，理論等電點分別為為5.39 、5.31。牦牛和犏牛TSPY蛋白的氨基酸序列中Glu的使用頻率最高(均為11.4%)，不含Pyl和Sec。預測蛋白正電荷18位，基酸殘基數(shù)(Arg+Lys)分別為43個和42個，負電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu)均為53個。牦牛具有8個Ser磷酸化位點，犏牛為7個，Thr磷酸化位點和Tyr磷酸化位點二者均為3個和1個，Ser磷酸化位點的不同是由于二者第98位氨基酸序列的差異導致(表3)，犏牛失去的催化激酶為周期蛋白依賴性激酶抑制因子，即CKI。蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)分別為66.54、64.28(不穩(wěn)定系數(shù)>40為不穩(wěn)定蛋白，不穩(wěn)定系數(shù)<40為穩(wěn)定蛋白)，說明牦牛和犏牛TSPY蛋白較不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性綜合GRAVY(grand average of hydropathicity)分別為-0.750、-0.751(疏水性指數(shù)> 0為疏水性蛋白,疏水性指數(shù)<0為親水性蛋白)，說明蛋白的親水性較強。牦牛和犏牛TSPY蛋白均不存在信號肽。

2.2.3 亞細胞定位預測 亞細胞定位預測發(fā)現(xiàn)牦牛TSPY蛋白主要定位于細胞質(zhì)(60.9%)和細胞核(30.4%)中，但在細胞骨架(4.3%)和線粒體(4.3%)中也有少量分布；犏牛TSPY蛋白也主要定位于細胞質(zhì)(65.2%)和細胞核(30.4%)中，在線粒體中有少量分布(4.3%)，但卻未見細胞骨架中有分布。

2.2.4 保守結(jié)構(gòu)域預測 對牦牛和犏牛TSPY蛋白進行保守結(jié)構(gòu)域預測，發(fā)現(xiàn)它與普通牛、人、鼠一樣都含有PTZ00007(153-310)超家族和NAP(分別為134-310、141-310)結(jié)構(gòu)域(圖5和圖6)，這兩個結(jié)構(gòu)域均與核小體組裝有關(guān)，其中，NAP蛋白參與組蛋白在細胞核、核小體和染色質(zhì)中流動[20]，影響很多基因的轉(zhuǎn)錄，由此推測牦牛和犏牛TSPY可能也有基因的轉(zhuǎn)錄有關(guān)。

圖3 牦牛和犏牛TSPY蛋白序列的保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domains of TSPY protein in yak and cattle-yak

2.2.5 二級結(jié)構(gòu)預測 使用PBIL上的在線軟件預測TSPY蛋白的二級結(jié)構(gòu)，表明該蛋白主要含有α-螺旋(h表示)、無規(guī)則卷曲(c表示)、β轉(zhuǎn)角(t表示)和伸展鏈(e表示)，其中主要為α-螺旋和無規(guī)則卷曲，其余含量相對較少(圖4)。對犏牛、牦牛和普通牛的氨基酸序列差異進行分析，發(fā)現(xiàn)犏牛第38位氨基酸發(fā)生了突變，由V變?yōu)锳(表3)。犏牛中突變的氨基酸引起了相鄰蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，由伸展鏈變?yōu)闊o規(guī)則卷曲。

圖4 牦牛和犏牛TSPY蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測 Fig.4 The second structure of TSPY protein in yak and cattle-yak

3 討 論

犏牛雄性不育主要是由精子發(fā)生過程中減數(shù)分裂障礙所引起的。哺乳動物精母細胞減數(shù)分裂是精子發(fā)生過程中的關(guān)鍵步驟，參與減數(shù)分裂調(diào)控的基因發(fā)生缺失或突變?nèi)菀滓馃o精子癥和男性不育[21-24]。TSPY被認為為在雄性減數(shù)分裂過程中參與了精原細胞和初級精母細胞的調(diào)節(jié)[25-26]。Veronika Svacinova[28]對人類TSPY基因的研究發(fā)現(xiàn)，TSPY基因的突變與男性不育癥患者的生育能力受損有關(guān)，在幾乎一半的男性不育癥患者中，該基因第36-42位氨基酸AGAGAGG或缺失或被CAT所替代。在本研究中，克隆了牦牛和犏牛TSPY基因序列。犏牛TSPY基因與牦牛和普通牛相比，第113位核酸位點發(fā)生了改變(T→C)，導致第38位氨基酸發(fā)生變化(V→V→A)，并引起蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)相鄰構(gòu)型的變化。更值得注意的是，該突變位點位于TSPY基因的第一外顯子區(qū)域，而第一個外顯子可能會影響精子發(fā)生過程[27]，因此，作者認為該位點的突變可能與犏牛雄性不育有一定的關(guān)系，TSPY基因可能是犏牛雄性不育的候選基因，具體調(diào)控機制還需從蛋白質(zhì)角度進一步驗證。

人TSPY基因的多數(shù)研究表明，在男性不育癥患者中，TSPY重復基因成為全基因組不穩(wěn)定的熱點區(qū)域，可導致TSPY可變剪接體表達，正常的基因不再表達，并且拷貝數(shù)也發(fā)生變化，基因重排[28-30]。Vodicka等[31]發(fā)現(xiàn)TSPY基因拷貝數(shù)量的增加與不育有關(guān)，而數(shù)量減少對表型的影響還不清楚，有待于進一步的研究。Giachini等[32]通過臨床試驗研究發(fā)現(xiàn)TSPY基因拷貝數(shù)的變化影響精子發(fā)生，并且認為低TSPY拷貝數(shù)成為雄性不育癥的一個新的風險因素。在本試驗中，預測到犏牛TSPY蛋白是不穩(wěn)定蛋白。那么該蛋白是否與人一樣，由于不穩(wěn)定造成TSPY基因拷貝數(shù)的變化，進而導致犏牛雄性不育，還有待于進一步的研究。

牦牛和犏牛TSPY基因的編碼區(qū)有1 個 CpG 島，包含全部擴增序列，第一外顯子區(qū)域與精子發(fā)生密切相關(guān)[27]。本試驗中，TSPY基因第一個外顯子含有容易被甲基化的CpG島，在今后的研究中，可通過對牦牛、普通牛和犏牛TSPY基因外顯子1的甲基化差異狀況來探討犏牛雄性不育的原因。

4 結(jié) 論

本研究首次克隆了牦牛和犏牛TSPY基因編碼區(qū)序列，并分析其生物信息學，這為進一步研究牦牛和犏牛TSPY基因的功能和作用奠定了基礎(chǔ)，為今后研究犏牛雄性不育提供了一定的理論依據(jù)。

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