張 林， 黃俊琪

(中山大學中山醫(yī)學院免疫學研究所，教育部熱帶病防治研究重點實驗室，廣東廣州510080)

全球每年大約有五千萬人感染登革病毒(dengue virus)，這已成為嚴重的公共衛(wèi)生問題［1-2］。登革病毒感染可引起登革熱(dengue fever，DF)和重癥登革熱，即登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)和登革休克綜合征(dengue shock syndrome，DSS)。DF發(fā)病機制至今尚未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)單核巨噬細胞是登革病毒感染的靶細胞［3］，外源性凋亡途徑參與登革病毒感染誘導的單核細胞凋亡［4-5］，但內(nèi)源性途徑是否同時參與其中，以及凋亡對登革病毒復制有無影響，尚未見相關(guān)文獻報道。我們用小鼠單核巨噬細胞系RAW264．7為模型，探討登革病毒感染誘導單核細胞凋亡的機制，進一步了解凋亡對病毒復制的影響。

材料和方法

1 材料

1．1 病毒和細胞 2型登革病毒(dengue virus type 2，DENV2)標準株NGC和C6/36細胞來自中山大學中山醫(yī)學院微生物學教研室，由本實驗室進行擴增和保存。RAW264．7細胞由本教研室擴增保存。

1．2 主要試劑及檢測儀器 培養(yǎng)基為DMEM/F12、胎牛血清和青鏈霉素雙抗。噻唑藍［3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2， 5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］為 Sigma產(chǎn)品。Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒為凱基產(chǎn)品。Hoechst 33342為Sigma產(chǎn)品。Caspase-9 Assay Kit為Invitrogen產(chǎn)品?？筩aspase-3和caspase-8活化片段抗體為Abcam產(chǎn)品。JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒為Genmed產(chǎn)品。ZVAD-FMK為Sigma產(chǎn)品。FACSCalibur流式細胞儀為BD產(chǎn)品。Axio Observer Z1熒光顯微鏡為Carl Zeiss產(chǎn)品。酶標儀為BioTek產(chǎn)品。Western blotting設備為天能產(chǎn)品。

2 方法

2．1 細胞培養(yǎng) RAW264．7細胞用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2孵育箱中培養(yǎng)及傳代。C6/36細胞用10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于28℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2．2 登革病毒感染 DENV2按常規(guī)進行擴增定量，病毒滴度為1×1010pfu/L，以感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為1加入病毒吸附2 h。加入完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下維持培養(yǎng)，分別于24 h、36 h和48 h后吸走培養(yǎng)上清存儲用于后續(xù)實驗，收集細胞做相應處理。

2．3 MTT法 收集處于對數(shù)生長期的RAW264．7細胞用含1×10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成細胞懸液，調(diào)整細胞濃度，以每孔1×104/100μL接種于96孔培養(yǎng)板中。在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。對照組及感染組培養(yǎng)6 h、12 h、24 h、36 h和48 h后每孔加入5 g/L MTT 10μL孵育4 h。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μL DMSO，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解，酶標儀490 nm處測定各孔吸光度(A)。

2．4 Hoechst 33342染色 收集各時點感染組及對照組的細胞1 500 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)上清。用PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min。用 Hoechst工作液(2．5 mg/L)避光孵育5 min。細胞涂片免疫熒光顯微鏡下觀察。

2．5 Annexin V-FITC/PI雙染和流式細胞術(shù)檢測凋亡 收集病毒感染細胞，1 500 r/min離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用PBS洗滌1次，1 500 r/min離心5 min。用200μL的緩沖液(loading buffer)重懸細胞。以未感染組為空白和單染樣本，每管按照要求加入2 μL PI或 2μL Annexin V-FITC，室溫孵育15 min上機檢測。

2．6 Western blotting檢測活化caspase-3及caspase-8含量 收集細胞，PBS洗滌1次，用蛋白提取試劑盒按照說明書提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。12%聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，蛋白分離后220 mA轉(zhuǎn)膜1 h。5%脫脂奶粉封閉1 h。相應Ⅰ抗4℃孵育過夜，洗滌后Ⅱ抗孵育1 h。曝光顯影。

2．7 Caspase-9活性檢測 采用caspase-9活性蛋白酶檢測試劑盒測定。取登革病毒感染和對照的各組細胞裂解提取總蛋白，定量并稀釋至終濃度2 mg/L。操作嚴格按照試劑盒說明書進行。酶標儀于405 nm波長處讀取吸光度值。

2．8 JC-1染色 細胞鋪在12孔板內(nèi)，按要求感染細胞，按照JC-1試劑盒說明書進行實驗前準備，每孔加入1 mL Genmed清理液(reagent C)清洗1次，每孔加入450μL配好的工作液。37℃細胞培養(yǎng)箱孵育20 min(注意避光)。吸走工作液，加入Genmed清理液(reagent C)覆蓋培養(yǎng)孔表面，即刻在熒光顯微鏡下觀察。

2．9 TCID50檢測細胞上清病毒滴度 收集Z-VADFMK預處理組及對照組的感染細胞上清，在離心管中進行連續(xù)10倍的稀釋，從10－1到10－6。在每孔加入細胞懸液100μL，使細胞量達到1×108/L。將稀釋好的上清接種到96孔微量培養(yǎng)板中，每一稀釋度接種一縱排共6孔，每孔接種100μL。設正常細胞對照，正常細胞對照接種兩縱排(100μL生長液+100μL細胞懸液)。逐日觀察并記錄結(jié)果。按照公式lgTCID50=L－d(s－0．5)計算病毒滴度。

3 統(tǒng)計學處理

采用 SPSS 13．0統(tǒng)計軟件分析，計量資料用(mean±SD)表示，組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 登革病毒感染RAW264．7細胞抑制細胞活性

MTT檢測發(fā)現(xiàn)，RAW264．7細胞在感染登革病毒24 h、36 h及48 h后細胞活性受到顯著抑制，6 h和12 h抑制不明顯。感染組6 h、12 h、24 h、36 h和48 h各時點 A 值為 1．438 ±0．108、1．263 ±0．146、1.102 ±0．102、0．755 ±0．051 和 0．696 ±0．021;對照組6 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 各時點 A 值為1．409 ±0.078、1．324 ±0．128、1．418 ±0．165、1．316 ±0．173 和1．332±0．129。6 h和12 h病毒感染組與對照組A值無顯著差異，24 h、36 h和48 h病毒感染組與對照組A值的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見圖1。

2 登革病毒感染RAW264．7細胞引起細胞核發(fā)生變化

Hoechst 33342染色免疫熒光顯微鏡觀察可見核固縮、染色變深等現(xiàn)象(箭頭所指)，見圖2。

Figure 1．The viability of RAW264．7 cells were inhibited by dengue virus．RAW264．7 cells were infected(MOI=1)with dengue virus for different time(6 h，12 h，24 h，36 h and 48 h)，and then cell viability was detected by MTT assay．Mean ± SD．n=6．*P ＜ 0．05 vs control．圖1 登革病毒感染抑制RAW264.7細胞活性

Figure 2．Nuclear changes of RAW264．7 cells infected with dengue virus．RAW264．7 cells were infected(MOI=1)with dengue virus for different time(24 h，36 h and 48 h)，and Hoechst 33342 staining was detected by fluorescence microscopy(scale bar=20 μm)．Arrowheads indicate karyopycnosis．圖2 登革病毒感染RAW264．7細胞引起細胞核發(fā)生變化

3 登革病毒感染誘導RAW264．7細胞凋亡

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，登革病毒感染24 h、36 h及48 h后凋亡率分別為(14．06±0．30)%、(21．66 ±4．72)%和(29．40 ±3．17)%;對照組的凋亡率分別為(4．52 ±0．89)%、(9．33 ±3．31)% 和(9.41±2．23)%。感染組細胞凋亡率均較未感染組高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)。且隨著時間的延長，細胞凋亡率增加，見圖3。

4 登革病毒感染后caspase-3、caspase-8活化片段表達增加

Western blotting結(jié)果顯示，登革病毒感染RAW 264.7細胞24 h、36 h和48 h后caspase-3和caspase-8活化片段表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0．05)，見圖4。

5 病毒感染后caspase-9活性增加

Caspase-9活性檢測結(jié)果顯示，在登革病毒感染24 h、36 h和48 h后感染組caspase-9活性的A值分別為 0．122 ± 0．024、0．153 ± 0．020 和 0．171 ±0.008;對照組caspase-9活性的A值分別為0．097±0．027、0．109 ±0．034 和 0．114 ±0．017。各時點感染組caspase-9活性均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0．05)，見圖5。

Figure 3．Apoptosis of RAW264．7 cells induced by dengue virus．RAW264．7 cells were infected(MOI=1)with dengue virus for different time(24 h，36 h and 48 h)，and Annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry were used to detect the apoptosis of cells．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control．圖3 登革病毒感染誘導RAW264．7細胞凋亡

6 JC-1染色結(jié)果表明登革病毒感染后細胞線粒體膜電位下降

正常細胞中線粒體膜電位較高，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物而產(chǎn)生紅色熒光;細胞凋亡后線粒體膜電位下降使JC-1無法進入線粒體，只能在胞質(zhì)中以單體形式存在，從而產(chǎn)生綠色熒光。JC-1染色結(jié)果表明，感染組和未感染組相比綠色熒光增強，紅色熒光減弱，提示登革病毒感染導致線粒體膜電位降低，見圖6。

7 抑制凋亡使感染細胞上清液中病毒滴度增加

凋亡抑制劑Z-VAD-FMK預處理組24 h、36 h和48 h登革病毒感染上清病毒滴度分別為3．29±0.40、3．75 ±0．21 和4．25 ±0．21;對照組登革病毒感染上清各時點病毒滴度為 2．29 ±0．19、2．75 ±0．12和3．54±0．26。Z-VAD-FMK預處理組感染細胞上清病毒滴度高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖 7。

Figure 4．Dengue virus infection induced caspase-3 and caspase-8 activation．Mean ± SD．n=3．*P ＜0．05 vs control．圖4 登革病毒感染導致caspase-3和caspase-8的活化

Figure 5．Caspase-9 activity of RAW264．7 cells infected with dengue virus．Mean ± SD．n=3．*P ＜ 0．05 vs control．圖5 登革病毒感染對RAW264．7細胞caspase-9活性的影響

Figure 6．Dengue virus infection decreased mitochondrial membrane potential of RAW264．7 cells．RAW264．7 cells were infected(MOI=1)with dengue virus for different time(24 h，36 h and 48 h)，and JC-1 staining was detected by fluorescence microscopy(scale bar=20 μm)．圖6 登革病毒感染導致線粒體膜電位降低

討 論

單核巨噬細胞為登革病毒感染的靶細胞，病毒在單核巨噬細胞內(nèi)復制后可以通過血液播散到全身。登革病毒感染單核巨噬細胞可以誘導大量的炎癥細胞因子的產(chǎn)生，包括IL-6、IL-8和 TNF-α等，與重癥登革熱有非常密切的關(guān)系。登革病毒與單核的巨噬細胞之間的相互作用對臨床轉(zhuǎn)歸有很重要的影響［6］，病毒誘導細胞凋亡是病毒和感染細胞相互作用一個很重要的方面。凋亡在登革病毒感染過程中有著雙重的作用，一方面凋亡是機體清除入侵病原體的一種方法，可以去除被感染細胞，限制病原體擴散;另一方面細胞的過度凋亡減少了細胞的數(shù)量，其它細胞對凋亡小體的吞噬也導致了一些抑炎因子的產(chǎn)生，從而削弱了機體的免疫反應。機體急性炎癥反應的消退部分依賴于細胞的凋亡，包括單核巨噬細胞的凋亡［7］。已有文獻報道登革病毒可以誘導單核巨噬細胞發(fā)生凋亡，并證明了外源性途徑參與其中［4-5］，但具體內(nèi)源性途徑是否也參與其中則無相關(guān)文獻報道。凋亡的外源性途徑通過死亡受體如Fas等激活caspase-8進而誘導細胞凋亡;凋亡的內(nèi)源性途徑主要是線粒體膜通透性的改變通過一系列信號轉(zhuǎn)導如caspase-9等激活caspase家族的下游如caspase-3，最終導致細胞凋亡的發(fā)生［8-11］。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn)登革病毒感染導致單核巨噬細胞活性下降，細胞核Hoechst 33342染色免疫熒光顯微鏡檢測顯示感染后細胞核有固縮和顏色變深的現(xiàn)象。進一步用流式細胞術(shù)定量分析細胞凋亡發(fā)現(xiàn)登革病毒感染能誘導單核巨噬細胞株 RAW264．7細胞產(chǎn)生凋亡，且隨著感染時間的增加細胞凋亡率增加。接著我們發(fā)現(xiàn)在登革病毒感染RAW264．7細胞過程中caspase-9活性增加，caspase-3及caspase-8活化片段的表達量上升，JC-1染色發(fā)現(xiàn)病毒感染后細胞線粒體膜電位降低。我們的結(jié)果表明在登革病毒誘導的細胞凋亡中內(nèi)、外源途徑都參與其中。

但凋亡的內(nèi)、外源途徑相互關(guān)系如何，這些凋亡途徑的具體激活機制以及凋亡對病毒復制的影響還有待深入研究。有文獻報道IRF-3/Bax介導的凋亡途徑抑制了仙臺病毒在小鼠胚胎成纖維細胞內(nèi)的復制，但在單核巨噬細胞系，凋亡對登革病毒復制的影響尚無相關(guān)文獻報道［12］。我們發(fā)現(xiàn)抑制登革病毒誘導的細胞凋亡使其培養(yǎng)上清的病毒滴度增加，但這是由于細胞活性在數(shù)量和質(zhì)量上的提高，還是登革病毒感染誘導的細胞中某些凋亡途徑抑制了其復制，具體機制仍需要探討。

總之，我們發(fā)現(xiàn)登革病毒可以誘導其靶細胞凋亡，內(nèi)、外源性途徑都參與其中;而凋亡抑制了病毒的復制。我們的結(jié)果為更好地理解病毒感染與宿主免疫細胞相互作用提供一個理論基礎。另外由于小鼠對登革病毒的免疫反應不同而無法建立小鼠登革病毒感染模型，我們的研究也為深入了解人鼠不同免疫反應的機制提供一些幫助。

Figure 7．Z-VAD-FMK pretreatment increased virus titer in cell culture medium．In control group，RAW264．7 cells were infected(MOI=1)with dengue virus for different time(24 h，36 h and 48 h)．RAW264．7 cells were pretreated with Z-VAD-FMK in Z-VAD-FMK group，and then infected(MOI=1)with dengue virus for different time(24 h，36 h and 48 h)．Culture medium was collected and virus titer were detected by TCID50．Mean ±SD．n=3．*P ＜0．05 vs DENV2．圖7 Z-VAD-FMK預處理增加了感染細胞培養(yǎng)上清中的病毒滴度