易月娥， 聶彥娜， 李姝玉， 李玉杰， 柴欣樓， 賈德賢， 王 謙△

(1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029;2山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東濟(jì)南250012)

糖尿病腎病是糖尿病最典型的微血管并發(fā)癥之一，屬中醫(yī)學(xué)“消渴病”繼發(fā)的“水腫”、“關(guān)格”等病證的范疇，已成為糖尿病患者致死的主要原因。糖尿病腎病的進(jìn)展過程中炎癥和纖維化是很重要的一個病理改變，主要包括腎小球和腎小管的炎癥和纖維化，而腎小管的病變出現(xiàn)在腎小球病變之前，且對于疾病預(yù)后更具有指導(dǎo)意義［1］。在腎小管上皮細(xì)胞慢性病變過程中，腎小管上皮－間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition，EMT)是炎癥和纖維化的關(guān)鍵機(jī)制［2-3］，即腎小管上皮細(xì)胞激活后成為具有分泌和收縮能力的肌成纖維細(xì)胞(myofibroblast，MyoF)。MyoF分泌膠原的能力是成纖維細(xì)胞4～5倍，大量細(xì)胞外基質(zhì)的生成和累積，導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。而轉(zhuǎn)化生長因子 β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)是最常見的誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的細(xì)胞因子之一［4-6］，它與轉(zhuǎn)分化標(biāo)志物 α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)呈正相關(guān)。因此，我們通過觀察葛根素注射液對KKAy糖尿病小鼠腎間質(zhì)纖維化的治療過程中TGF-β1、轉(zhuǎn)化生長因子 βI型受體(transforming growth factor β type I receptor，TGF-β-RI)和 α-SMA表達(dá)的影響，探討中藥葛根素治療腎間質(zhì)纖維化的機(jī)制，為中醫(yī)藥防治腎間質(zhì)纖維化提供實驗依據(jù)。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 SPF級KKAy小鼠16只，雄性，9～11周齡，25～28 g，購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心，KKAy小鼠許可證編號為SCXK(京)2005-0013，隨機(jī)血糖≥13．9 mmol/L確定為糖尿病小鼠。C57BL/6J小鼠10只，雄性，9～11周齡，23～25 g，C57BL/6J小鼠許可證編號為SCXK(京)2002-0003，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)于中日友好醫(yī)院臨床研究所實驗動物中心屏障系統(tǒng)，KKAy小鼠給予高脂飼料(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物中心)，普通飲水;C57BL/6J小鼠給予小鼠生長維持顆粒飼料(購自北京科澳協(xié)力飼料有限公司)，普通飲水。

1．2 藥物和主要試劑 葛根素注射液購自浙江康恩貝制藥股份有限公司;α-SMA抗體(Ⅰ抗)為兔抗大鼠、小鼠、人多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司);TGF-β1抗體(Ⅰ抗)為人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;TGF-β-R1抗體(Ⅰ抗)為人多克隆抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);含HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG(Ⅱ抗)及高敏過氧化物酶復(fù)合物的免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司，濃縮型DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司?？乖迯?fù)液(0．01 mol/L、pH 6．0 檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液)和 PBS(0．01 mol/L，pH 7.2)。

1．3 主要儀器 微量加樣器(Eppendorf)、保濕盒、37℃溫箱、冰箱(海爾)、Image-Pro Plus 5．1 圖像分析軟件、搖床、電漩渦混合器、普通冰箱、電動玻璃勻漿器、精密pH計、電子天平、電磁爐等。

2 方法

2．1 實驗?zāi)Ｐ图胺纸M KKAy小鼠高脂飼養(yǎng)至14周齡時，將KKAy小鼠按隨機(jī)血糖分組，將隨機(jī)血糖≥13．9 mmol/L的 KKAy小鼠確定為糖尿病小鼠。動物分籠飼養(yǎng)，每天觀察小鼠一般狀態(tài)。將動物分為模型組(8只)，高脂飼料喂養(yǎng);治療組(8只)，高脂飼料喂養(yǎng)，另外每日腹腔注射葛根素注射液(1．3 mL·kg－1·d－1);C57BL/6J小鼠 8 只作正常組。以上各組動物均自由飲食，飲水，于24周齡處死動物，所取組織立即浸入液氮，取材結(jié)束后轉(zhuǎn)入液氮罐。

2．2 小鼠血糖檢測 剪尾取血檢測16周齡、20周齡和24周齡各組小鼠空腹血糖。

2．3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 將所取的小鼠腎組織用4%多聚甲醛溶液固定，2周后進(jìn)行石蠟包埋切片。將組織切片按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色，光鏡觀察。

2．4 免疫組化法檢測KKAy小鼠腎臟組織α-SMA、TGF-β1和 TGF-β-RI表達(dá)改變 常規(guī)制作的 KKAy小鼠腎組織石蠟切片，采用二步法免疫組化染色，按照即用型SABC法免疫組化試劑盒說明書步驟操作，Ⅰ抗分別為 α-SMA(1∶500)、TGF-β1(1∶200)和 TGF-β-RI(1∶400)，用 PBS(0．01 mol/L)代替Ⅰ抗作為陰性對照。中性樹膠封片，顯微鏡觀察;照相，保存。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17．0統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠一般狀態(tài)

除正常組小鼠外，其余組小鼠均有精神不振，活動遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤，而且隨著周齡增加癥狀加重。治療組以上情況得到不同程度的改善。

2 空腹血糖

從16周齡開始模型組及治療組小鼠血糖比正常組高，治療組小鼠血糖較模型組血糖明顯降低;比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0．05或 P ＜0．01)，見表1。

表1 小鼠空腹血糖檢測結(jié)果Table 1．The change of blood glucose in each group(Mean±SD)

3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察

普通光鏡觀察可見24周齡正常組小鼠腎小管和腎小球結(jié)構(gòu)完整清晰，無間質(zhì)纖維化。24周齡模型組小鼠腎小球系膜細(xì)胞及系膜基質(zhì)增多，腎小管上皮細(xì)胞胞漿出現(xiàn)明顯空泡，腎間質(zhì)可見炎細(xì)胞增多。治療組24周齡KKAy小鼠腎小管上皮細(xì)胞胞漿少量空泡，間質(zhì)纖維化不明顯，見圖1。

Figure 1．Pathological changes of the kidney tissues from24-week-old KKAy mice and C57BL/6Jmice(HE staining，×400)．A:normal group C57BL/6Jmice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖1 24周小鼠正常組、模型組及治療組的病理組織學(xué)改變

4 免疫組化實驗結(jié)果

4．1 α-SMA蛋白表達(dá)情況 普通光鏡觀察小鼠腎臟組織，免疫組化染色顯示:模型組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)α-SMA的表達(dá)較正常組和治療組明顯增多。治療組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)α-SMA的表達(dá)也有增多，但不如模型組明顯，見圖2、表2。

Figure 2．The expression ofα-SMA in the kidney tissues of KKAy mice and C57BL/6J mice(immunohistochemical saining，×400)．A:normal group C57BL/6J mice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖2 24周小鼠腎臟α-SMA免疫組化觀察

4．2 TGF-β1蛋白和TGF-β-RI蛋白的表達(dá) 普通光鏡觀察小鼠腎臟組織TGF-β1蛋白和TGF-β-RI蛋白表達(dá)顯示，正常組和治療組腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)均有較弱的表達(dá);模型組與正常組和治療組相比，腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)表達(dá)呈強(qiáng)陽性，圖3、4和表2。

討 論

葛根素注射液為傳統(tǒng)中藥葛根的提取物的滅菌水溶液(2 mL相當(dāng)于藥材0．1 g)，主要成分為葛根素，是由豆科植物野葛的干燥根中提取的一種黃酮苷，葛根素為臨床證明有效的單味中藥提取物。近年多項研究表明葛根素可通過對抗腎上腺素的升血糖作用、減少血清晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)的形成、下調(diào) AGEs受體的過度表達(dá)、對抗蛋白糖基化的發(fā)展等機(jī)制來有效調(diào)節(jié)血糖，具有一定程度地預(yù)防和治療糖尿病發(fā)生血管并發(fā)癥的效果［7-10］。此外，葛根素還可降低糖尿病大鼠腎組織中TGF-β1的表達(dá)及活性［11］。而本實驗運用葛根素注射液對KKAy糖尿病小鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察小鼠血糖的動態(tài)變化及形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，并研究貫穿于整個EMT過程中的重要指標(biāo)α-SMA、TGF-β1及其受體的變化，以探索葛根素對腎間質(zhì)纖維化的治療作用。我們的實驗結(jié)果顯示，隨著KKAy小鼠病情的進(jìn)展，模型組小鼠較正常組表現(xiàn)精神不振，活動遲緩，尿量明顯增多，體毛缺乏光澤，治療組類似情況則得到相應(yīng)改善。形態(tài)學(xué)觀察也進(jìn)一步表明，相較于治療組，模型組腎組織發(fā)生了明顯的纖維化病變，治療組也有輕微的細(xì)胞間基質(zhì)增多，但較模型組輕。結(jié)合各組小鼠的血糖水平的檢測結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，我們運用葛根素注射液治療可改善糖尿病小鼠的血糖水平，有效地抑制KKAy小鼠腎纖維化的進(jìn)程。

Figure 3．The expression of TGF-β1 in the kidney tissues of KKAy mice and C57BL/6Jmice(immunohistochemical staining，×400)．A:normal group C57BL/6Jmice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖3 24周小鼠腎臟TGF-β1免疫組化觀察

Figure 4．The expression of TGF-β-R1 in the kidney tissues of KKAy mice and C57BL/6J mice(immunohistochemical staining，×400)．A:normal group C57BL/6J mice;B:model group KKAy mice;C:treatment group KKAy mice．圖4 24周小鼠腎臟TGF-β-RI免疫組化觀察

表2 免疫組化結(jié)果Table 2．The results of immunohistochemical staining(Mean±SD)

RIF是糖尿病腎病的嚴(yán)重病變，大量研究表明，在各種原因引起的慢性腎臟疾病中，腎間質(zhì)纖維化都可作為腎功能惡化的一個十分準(zhǔn)確的預(yù)測指標(biāo)。而在腎纖維化發(fā)生過程中，腎小管上皮細(xì)胞激活成為MyoF(即EMT)是其中心環(huán)節(jié)。EMT是一個有序的調(diào)節(jié)過程，有4個關(guān)鍵步驟:(1)上皮細(xì)胞失去黏附能力;(2)α-SMA的表達(dá)和肌動蛋白細(xì)胞骨架重新排列;(3)腎小管基底膜損傷;(4)細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)［12］。而在EMT發(fā)生發(fā)展的過程中，TGF-β1是最為重要的作用因子之一。TGF-β1是一種分泌蛋白質(zhì)，對細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡都有調(diào)控作用［13］。研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的上調(diào)是所有人類和實驗動物腎間質(zhì)纖維化的特征，并且TGF-β1能抑制基質(zhì)降解酶，吸引成纖維細(xì)胞和單核細(xì)胞等［14］，并且能使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化過程，促使正常的腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化為不能行使腎小管功能的成纖維細(xì)胞［15］。同時抑制腎小管上皮細(xì)胞的增殖，進(jìn)一步使腎臟喪失功能，從而引發(fā)一系列炎癥和纖維化的活動。TGF-β1的這些生物學(xué)作用需要通過與其受體結(jié)合而得以發(fā)揮，大多數(shù)細(xì)胞表面存在3種TGF-β1受體，分別為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型受體。一般認(rèn)為Ⅰ型受體決定TGF-β1反應(yīng)特異性，也決定了它的多種生物學(xué)功能［16］。TGF-β1與其受體結(jié)合后參與了TGF-β1介導(dǎo)的信號通路的激活，引起腎間質(zhì)纖維化。

在腎小管上皮轉(zhuǎn)分化的進(jìn)程中，腎小管上皮細(xì)胞可表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志蛋白:α-SMA。α-SMA在靜止?fàn)顟B(tài)的成纖維細(xì)胞中無表達(dá)，但在轉(zhuǎn)分化后α-SMA陽性的肌成纖維細(xì)胞是主要的基質(zhì)合成細(xì)胞［17-18］，是腎臟固有細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成MyoF后合成的一種特征性蛋白，其在腎臟局部的表達(dá)高低可間接反映MyoF的數(shù)量及腎臟纖維化程度［19］。α-SMA的出現(xiàn)不僅為轉(zhuǎn)分化細(xì)胞提供形態(tài)學(xué)的界定，也為轉(zhuǎn)分化細(xì)胞的遷移、浸潤以及收縮能力的獲取提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

本研究中，我們用免疫組化技術(shù)觀察不同組別間α-SMA、TGF-β1及其受體表達(dá)的差異，結(jié)果顯示模型組α-SMA顆粒遠(yuǎn)多于正常組和治療組，而TGF-β1及其受體在正常組和治療組中有少量表達(dá)，在模型組中大量表達(dá)，說明葛根素注射液可有效抑制α-SMA、TGF-β1及其受體的表達(dá)。

綜上所述，在糖尿病腎病腎纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中，葛根素注射液治療可抑制α-SMA、TGF-β1和TGF-β-RI的表達(dá)，有效改善糖尿病小鼠的癥狀，降低小鼠血糖，可有效地抑制腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生發(fā)展，為葛根素注射液治療DN提供了實驗依據(jù)，但其更深入調(diào)控機(jī)制及更廣泛的臨床應(yīng)用，仍需要進(jìn)一步探索和研究。