車玉傳， 蘇運(yùn)欽， 溫旺榮

(暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，廣東廣州510630)

宮頸癌是世界女性中僅次于乳腺癌和結(jié)直腸癌的第3個(gè)常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性健康和生命，因此對(duì)宮頸癌的早期診斷具有重要意義。微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是近年來熱點(diǎn)研究的一類高度保守的內(nèi)源性、非編碼單鏈小分子RNA，主要通過與特定靶基因mRNA的3'端非翻譯區(qū)(untranslated region，UTR)完全或不完全互補(bǔ)配對(duì)而在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控靶基因表達(dá)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，部分miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［1-4］。miR-155-5p是最早發(fā)現(xiàn)的具有促癌活性的 miRNA，在宮頸癌［5］、子宮內(nèi)膜癌［6］、乳腺癌［7］、大腸癌［8］、胰腺癌［9］、肺癌［10］等惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。血清中也存在miR-155-5p，其能夠?qū)购颂呛怂崦傅慕到舛３址€(wěn)定性，然而miR-155-5p在宮頸癌患者血清中的表達(dá)及功能研究尚未見報(bào)道，本研究擬采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)miR-155-5p在宮頸癌患者血清中的表達(dá)情況，并通過miR-155-5p mimic或inhibitor上調(diào)或抑制宮頸癌細(xì)胞miR-155-5p的表達(dá)，觀察miR-155-5p對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響，了解miRNA在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制，探討miR-155-5p在宮頸癌早期診斷和治療中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料和方法

1 研究對(duì)象

收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院2012年1月至2013年5月初診的宮頸癌患者15例，宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)患者15例和慢性宮頸炎患者12例，收集同期體檢的健康對(duì)照女性血清標(biāo)本15例。排除標(biāo)準(zhǔn):非初診患者，即已接受過手術(shù)、放療、化療等不同治療的患者;伴有心、肝、腦、腎、肺等器官及血液系統(tǒng)疾病。所有血清標(biāo)本收集立即置于－80℃冰箱保存。宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞由中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心饋贈(zèng)。

2 主要儀器

LightCycler 1．5 Instrument(Roche);Prism 7000熒光定量 PCR儀 (ABI);熒光倒置顯微鏡(Olympus);Biophotometer生物分光光度計(jì)(Eppendorf);高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf);酶標(biāo)儀(Bio-Rad);凝膠成像系統(tǒng)(Alpha);生物安全柜(ESCO)。

3 主要試劑

miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技有限公司);脂質(zhì)體LipofectamineTM2000(Invitrogen);Trizol試劑(Invitrogen);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒與SYBR Green熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(TaKaRa);miR-155-5p及內(nèi)參照U6 snRNA特異逆轉(zhuǎn)錄及qRTPCR引物、miR-155-5p mimic和 inhibitor(廣州市銳博生物科技有限公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco);1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素溶液(Gibco);無支原體胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);無血清培養(yǎng)基 Opti-MEMⅠ(Gibco);CCK-8檢測(cè)試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所);細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒(Sigma);凋亡檢測(cè)試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司);其它常規(guī)化學(xué)試劑均為分析純產(chǎn)品。

4 血清miRNA和細(xì)胞總RNA的提取

4．1 血清 miRNA提取 取450μL血清，嚴(yán)格按miRcute miRNA提取分離試劑盒說明書操作提取，將提取的miRNA用15μL DEPC處理水溶解，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4．2 細(xì)胞總RNA提取 常規(guī)Trizol法提取細(xì)胞的總RNA。加入50μL DEPC水溶解RNA，反復(fù)吹打混勻，65℃烤箱助溶10 min，冰上冷卻5 min，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4．3 RNA純度及濃度的測(cè)定 取10μL總RNA，加0．1%DEPC 處理水 90μL稀釋 10倍，以 0．1%DEPC處理水做空白對(duì)照，超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA在波長(zhǎng)260 nm與280 nm的吸光度值，RNA溶液的A260/A280在1．8～2．1為純度合格。樣品RNA濃度(mg/L)=A260×40×樣本稀釋倍數(shù)。

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-155-5p的表達(dá)

5．1 miR-155-5p逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 反應(yīng)體系為10μL，包括5 × PrimeScript? Buffer 2 μL，PrimeScript? RT Enzyme Mix I 0．5 μL，特異性逆轉(zhuǎn)錄引物(5 μmol/L)0．2 μL，總 RNA 5 μL，RNase-Free dH2O 2．3 μL。反應(yīng)條件為42℃ 15 min，85℃ 5 s。內(nèi)參照U6 snRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參數(shù)同上。反應(yīng)設(shè)1復(fù)孔。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA保存于－20℃冰箱備用。

5．2 miR-155-5p qRT-PCR 反應(yīng)體系為20μL，包括SYBR? Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，上、下游引物(5 μmol/L)各1．6 μL，ROX Reference Dye(50 ×)0．4 μL，cDNA 模板2 μL，0．1%DEPC處理水4．4μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性30 s，95℃ 5 s、60℃ 31 s，40個(gè)循環(huán)。陰性對(duì)照以0．1%DEPC處理水代替逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。設(shè)置熔解曲線判斷是否存在引物二聚體和非特異性擴(kuò)增。內(nèi)參照U6 snRNA qRT-PCR參數(shù)同上。

6 細(xì)胞株的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HeLa和SiHa細(xì)胞株接種于含10% 胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以(2～4)×105cells/well種6孔板。轉(zhuǎn)染前1 d，每孔中加入1 000μL不含抗生素的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)至70% ～90% 融合度時(shí)，嚴(yán)格按照LipofectamineTM2000和廣州銳博生物科技有限公司miR-155-5p mimic和inhibitor使用說明書的條件進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。miR-155-5p mimic轉(zhuǎn)染分6組:空白組、脂質(zhì)體組、50 nmol/L mimic組、100 nmol/L mimic組、200 nmol/L mimic組和negative control組。miR-155-5p inhibitor轉(zhuǎn)染分5組:空白組、脂質(zhì)體組、100 nmol/L inhibitor組、200 nmol/L inhibitor組和negative control組。陰性對(duì)照是經(jīng)過生物信息學(xué)分析與人miRNA具有最小同源性的線蟲miRNA，適用于人miRNA實(shí)驗(yàn)的陰性對(duì)照。各自陰性對(duì)照終濃度為100 nmol/L。

7 CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況

按前述方法將miR-155-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細(xì)胞24 h后，經(jīng)胰酶消化收集細(xì)胞，在離心管內(nèi)將各組細(xì)胞懸液充分打勻，按HeLa細(xì)胞3×104cells/well、SiHa細(xì)胞 2 ×104cells/well接種于96孔板中，每孔加液量100μL，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。于 24 h、48 h、72 h、96 h，每組分別取 3個(gè)平行孔進(jìn)行檢測(cè)，將培養(yǎng)液去除，每孔加入100μL無血清培養(yǎng)基和10μL CCK-8試劑，在37℃、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm時(shí)的吸光度(A)。

8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-155-5p對(duì)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞周期和凋亡的影響

8．1 PI單染法檢測(cè)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞周期 以適量胰酶消化、收集轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌細(xì)胞，2 000 r/min離心5 min，并用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液洗滌、重懸細(xì)胞2次，棄上清，加入預(yù)冷的70%乙醇2 mL，混勻，于4℃固定過夜。第2天以1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞，1 000μL預(yù)冷磷酸緩沖液再次洗滌后加入400μL 50 mg/L碘化丙啶(propidium iodide，PI)和100μL 100 mg/L RNase A，4℃ 避光孵育30 min，以50μm尼龍網(wǎng)膜過濾細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。結(jié)果用細(xì)胞周期擬和軟件ModFit分析。每組重復(fù)3次。

8．2 Annexin V/PI雙染法檢測(cè)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞凋亡 以適量不含EDTA胰酶消化、收集轉(zhuǎn)染48 h后的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液洗滌、重懸細(xì)胞2次。以2 000 r/min離心5 min，收集(1～5)×105個(gè)細(xì)胞，離心沉淀，加入 500μL binding buffer懸浮細(xì)胞，向懸液中加入5μL Annexin V-FITC混勻染色，隨后加入5μL PI混勻染色，室溫下避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

9 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

qRT-PCR以U6 snRNA為內(nèi)參照，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行歸一化處理。采用相對(duì)定量法，樣品目的基因的相對(duì)定量(relative quantification，RQ)采用 ΔΔCt方法計(jì)算，ΔCt待測(cè)樣本=(CT樣本miR-155-5p－ Ct樣本U6snRNA)的均 數(shù) ± 標(biāo) 準(zhǔn) 差，ΔCt對(duì)照樣本= (Ct對(duì)照miR-155-5p－Ct對(duì)照U6snRNA)的均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差，ΔΔCt=(ΔCt待測(cè)樣本－ΔCt對(duì)照樣本)±標(biāo)準(zhǔn)差。RQ=2－ΔΔCt的均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差，表示實(shí)驗(yàn)組miR-155-5p相對(duì)于對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量。

數(shù)據(jù)均采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件處理，miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對(duì)照組血清中的相對(duì)表達(dá)量 2－ΔΔCt經(jīng)單樣本 Kolmogorov-Smimov檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布(Z=1．064，P=0．208 ＞0．10)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。經(jīng)Levene法檢驗(yàn)符合方差齊性條件(P=0．313＞0．10)，因此兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用Independent-Sample T test進(jìn)行檢驗(yàn)，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用One-way ANOVA分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR熔解曲線

miR-155-5p和U6 snRNA的熔解曲線為單峰，未見雜峰信號(hào)，表明引物擴(kuò)增的特異性較好，產(chǎn)物單一，無明顯非特異產(chǎn)物。miR-155-5p和U6 snRNA的熔解溫度非常接近，在82℃左右，見圖1。血清miR-155及U6 snRNA擴(kuò)增曲線呈標(biāo)準(zhǔn)S型。陰性對(duì)照產(chǎn)生的微弱非特異擴(kuò)增信號(hào)明顯滯后于實(shí)驗(yàn)組血清樣本的擴(kuò)增信號(hào)。

2 miRNA的cDNA擴(kuò)增及電泳檢測(cè)鑒定

對(duì)miR-155-5p和內(nèi)參照U6 snRNA的2次擴(kuò)增產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳，在100 bp左右出現(xiàn)明顯的亮帶，且與所推斷的目的片段大小范圍大致相符，為有效擴(kuò)增。產(chǎn)物條帶單一，無非特異性擴(kuò)增條帶，見圖2。

Figure 1．Melting curves for miR-155-5p and U6 snRNA．圖1 miR-155-5p和U6 snRNA熔解曲線

Figure 2．Electrophoresis results for miR-155-5p and U6 snRNA PCR products．M:TaKaRa 20 bp DNA ladder marker;1～3:U6 snRNA amplification products;4～6:miR-155-5p amplification products;NC1:U6 snRNA negative control;NC2:miR-155-5p negative control．圖2 miR-155-5p和U6 snRNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

表1 miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對(duì)照組血清中的表達(dá)差異Table 1．Differential expression of serum miR-155-5p in cervical cancer，CIN，cervicitis and healthy control group(Mean±SD)

Figure 3．The red fluorescence distribution of HeLa cells and SiHa cells 24 h after transfection(×100)．A:HeLa cells，phase-contrast;B:HeLa cells，fluorescence;C:SiHa cells，phase-contrast;D:SiHa cells，fluorescence．圖3 HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞紅色熒光分布

3 miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對(duì)照組血清中的表達(dá)差異情況

qRT-PCR檢測(cè)miR-155-5p在宮頸癌、CIN、宮頸炎和健康對(duì)照組血清樣本中相對(duì)于U6 snRNA的表達(dá)。經(jīng) One-way ANOVA檢驗(yàn)，可認(rèn)為4組血清中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量不同(P＜0．05)。經(jīng)多個(gè)樣本均數(shù)間兩兩比較的SNK檢驗(yàn)，宮頸癌組血清中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量高于宮頸炎組和健康對(duì)照組(P＜0．05)，CIN組和宮頸癌組血清中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)，CIN組、宮頸炎組和健康對(duì)照組血清中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見表1。

4 宮頸癌HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率觀察

轉(zhuǎn)染前1 d，接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞至6孔板中，每孔中加入1 mL不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到70% ～90%。以100 nmol/L終濃度將帶Cy3標(biāo)記的miRNA mimic陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h，熒光倒置顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)紅色熒光細(xì)胞的百分比例，結(jié)果顯示95%以上的HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞內(nèi)可見紅色熒光分布，細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率可達(dá)95%以上，見圖3。

5 miR-155-5p mimic和inhibitor轉(zhuǎn)染HeLa和Si-Ha細(xì)胞后miR-155-5p表達(dá)量的變化

轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimic后，2種細(xì)胞中miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量明顯上調(diào)，且隨著時(shí)間的推移，miR-155-5p mimic在細(xì)胞內(nèi)的降解逐漸加快，但其上調(diào)miR-155-5p的作用至少可以持續(xù)到轉(zhuǎn)染后96 h，見表2。miR-155-5p mimic在SiHa細(xì)胞中的降解速度比在HeLa細(xì)胞中快。由于miR-155-5p inhibitor競(jìng)爭(zhēng)性抑制的作用機(jī)制，即與miR-155-5p高效穩(wěn)定結(jié)合，減弱內(nèi)源性miR-155-5p對(duì)下游靶基因的調(diào)控作用，所以對(duì)細(xì)胞內(nèi)miR-155-5p相對(duì)表達(dá)量的下調(diào)并不明顯，見表3。

表2 miR-155-5p mimic轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-155-5p表達(dá)量的動(dòng)態(tài)性改變Table 2．The expression changes of miR-155-5p after transfected with miR-155-5p mimic(2 －ΔΔCt)

表3 miR-155-5p inhibitor轉(zhuǎn)染細(xì)胞后miR-155-5p表達(dá)量的動(dòng)態(tài)性改變Table 3．The expression changes of miR-155-5p after transfected with miR-155-5p inhibitor(2 －ΔΔCt)

6 miR-155-5p對(duì)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞增殖的影響

從圖4、5可見，用CCK-8法檢測(cè)miR-155-5p表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)對(duì)轉(zhuǎn)染后不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞增殖的影響發(fā)現(xiàn)，與空白細(xì)胞組、脂質(zhì)體組、陰性對(duì)照組相比，分別以 50 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 轉(zhuǎn)染 miR-155-5p mimic和以 100 nmol/L、200 nmol/L轉(zhuǎn)染miR-155-5p inhibitor，HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h的增殖差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，無時(shí)間和劑量依賴性。

Figure 4．The growth curves of HeLa and SiHa cells after transfected with miR-155-5p mimic．Mean ±SD．n=3．圖4 miR-155-5p mimic轉(zhuǎn)染后HeLa和SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Figure 5．The growth curves of HeLa and SiHa cells after transfected with miR-155-5p inhibitor．Mean ± SD．n=3．圖5 miR-155-5p inhibitor轉(zhuǎn)染后HeLa和SiHa細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

7 miR-155-5p對(duì)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞周期和凋亡的影響

用Levene法進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，不同組別HeLa和SiHa不同細(xì)胞周期階段和凋亡的百分率符合方差齊性條件(P＞0．10)。經(jīng)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)資料的方差分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155-5p mimic對(duì)Si-Ha細(xì)胞凋亡的影響不同(P＜0．05)。與空白組、脂質(zhì)體組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p mimic的SiHa細(xì)胞中，S期細(xì)胞比例升高，凋亡細(xì)胞比例降低(P＜0．05)。與空白組、脂質(zhì)體組和陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染50 nmol/L、100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p mimic以及轉(zhuǎn)染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p inhibitor對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。另外，轉(zhuǎn)染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p inhibitor的 SiHa細(xì)胞中，G2/M期細(xì)胞比例明顯增高(P＜0．05)，下調(diào)SiHa細(xì)胞miR-155-5p表達(dá)可能誘導(dǎo)G2/M期阻滯。轉(zhuǎn)染100 nmol/L和200 nmol/L miR-155-5p inhibitor對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡的影響與空白組、脂質(zhì)體組和陰性對(duì)照組相比，差別也均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)，見表4、5。

表4 miR-155-5p mimic對(duì)HeLa和SiHa細(xì)胞周期和凋亡的影響Table 4．The effects of miR-155-5p mimic on cell cycle and apoptosis of HeLa and SiHa cells 48 h after transfection(%．Mean±SD．n=3)

表5 miR-155-5p inhibitor對(duì)HeLa和SiHa細(xì)胞周期和凋亡的影響Table 5．The effects of miR-155-5p inhibitor on cell cycle and apoptosis of HeLa and SiHa cells 48 h after transfection(%．Mean±SD．n=3)

討 論

miRNA是一種內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，在mRNA水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。血清miRNA主要來源于凋亡或壞死的細(xì)胞、組織細(xì)胞的主動(dòng)分泌以及循環(huán)細(xì)胞的裂解。因此，miRNA在血清和組織中的表達(dá)具有較高的相似性。內(nèi)源性血清miRNA多數(shù)不是以游離形式存在，成熟后常與蛋白等構(gòu)成沉默復(fù)合體，因被蛋白保護(hù)而具有良好的抗RNase降解能力，盡管血清中miRNA豐度較組織中低得多，但是miRNA在血清中高度穩(wěn)定，這一特點(diǎn)為血清miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能、作為腫瘤標(biāo)志物提供了基礎(chǔ)［11］。

宮頸癌相關(guān)miRNA異常表達(dá)的臨床應(yīng)用研究已成為熱點(diǎn)。多種miRNA的異常表達(dá)與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［12］。通過對(duì)宮頸癌相關(guān)miRNA進(jìn)行鑒定和功能分析，發(fā)現(xiàn)宮頸癌中有明確靶基因的 miRNA 差異表達(dá)譜，如 miR-21、miR-29、miR-34、miR-143、miR-214、miR-372、miR-519、miR-17-5p 等，可能用于監(jiān)測(cè)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展。另外，Ke等［13］發(fā)現(xiàn)，相比于對(duì)放射治療較敏感的宮頸癌組織和細(xì)胞，在對(duì)放射治療不敏感宮頸癌組織和細(xì)胞，miR-181a表達(dá)上調(diào)。進(jìn)一步功能研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-181a能靶向負(fù)調(diào)控促凋亡蛋白激酶PRKCD(protein kinase C delta)基因的表達(dá)，抑制輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和減少G2/M阻滯，進(jìn)而抑制宮頸癌細(xì)胞放療敏感性，相反下調(diào)miR-181a能增加宮頸癌細(xì)胞PRKCD的表達(dá)，進(jìn)而提高宮頸癌細(xì)胞放療敏感性。因此，宮頸癌miR-181a表達(dá)水平可為評(píng)價(jià)宮頸癌患者放療敏感性提供有價(jià)值的參考指標(biāo)，同時(shí)靶向結(jié)合抑制miR-181a可能是增強(qiáng)宮頸癌放射治療敏感性的一種新方法。

本文研究的miR-155-5p定位于人染色體21q21，由 B細(xì)胞整合簇(B-cell integration cluster，BIC)基因第3個(gè)外顯子高度保守區(qū)編碼，在宮頸癌［5］、子宮內(nèi)膜癌［6］、乳腺癌［7］、大腸癌［8］、胰腺癌［9］、肺癌［10］等惡性腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用Stem-Loop SYBR GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)血清、HeLa和SiHa細(xì)胞中miR-155-5p的表達(dá)水平，設(shè)計(jì)具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物，只檢測(cè)成熟的miR-155-5p，并且能延長(zhǎng)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA，解決了因miRNA片段短而難于檢測(cè)的問題。熔解曲線和擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析結(jié)果證明了反應(yīng)的特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌患者血清中miR-155-5p相對(duì)于慢性宮頸炎和健康對(duì)照者表達(dá)升高，與李莉等［14］、Wang等［15］等在宮頸癌組織中發(fā)現(xiàn)miR-155-5p高表達(dá)相一致，說明miR-155-5p在宮頸癌患者血清和組織中的表達(dá)具有較高的相似性，miR-155-5p可能參與宮頸組織的惡變進(jìn)程，但在宮頸癌患者血清中miR-155-5p的豐度較低。另外，血清miR-155-5p含量在宮頸癌與CIN組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，是否與樣本例數(shù)有關(guān)有待進(jìn)一步證實(shí)。實(shí)驗(yàn)用Cy3標(biāo)記的100 nmol/L miR-155-5p mimic陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染HeLa和SiHa細(xì)胞，在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染率，95%以上細(xì)胞可見紅色熒光。本研究采用qPCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同濃度miR-155-5p mimic和inhibitor后HeLa和SiHa細(xì)胞中miR-155-5p的相對(duì)表達(dá)量，證實(shí)miR-155-5p mimic能有效上調(diào)miR-155-5p的表達(dá)。miR-155-5p mimic是運(yùn)用化學(xué)方法合成的雙鏈RNA，能模擬細(xì)胞中內(nèi)源性成熟miR-155-5p的高水平表達(dá)，以增強(qiáng)內(nèi)源性miR-155-5p的調(diào)控作用，進(jìn)行功能獲得性研究。相反，由于miR-155-5p inhibitor競(jìng)爭(zhēng)性抑制的作用機(jī)制，即通過與成熟miR-155-5p分子特異性結(jié)合，削弱內(nèi)源性miR-155-5p的基因調(diào)控作用，進(jìn)行功能缺失性研究，所以對(duì)HeLa和SiHa細(xì)胞內(nèi)miR-155-5p的表達(dá)量的下調(diào)并不明顯。本研究采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，與常用的MTT法相比，還原后的Formazan是水溶性的，不需要添加有機(jī)溶劑溶解，步驟少，重復(fù)性好，是一種更加簡(jiǎn)便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性檢測(cè)方法，為進(jìn)一步研究相關(guān)miRNA的體內(nèi)抗腫瘤作用奠定了基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-155-5p對(duì)人宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞的增殖無明顯作用，呈非時(shí)間劑量依賴方式。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)miR-155-5p mimic處理后SiHa細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)S期細(xì)胞比例增多，且表現(xiàn)出對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，呈非劑量依賴方式，但與CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果不一致。分析其原因，可能與miR-155-5p mimic在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中不穩(wěn)定，容易被降解有關(guān);也可能與細(xì)胞周期和凋亡信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的互補(bǔ)作用有關(guān)。進(jìn)一步的研究應(yīng)該通過構(gòu)建miR-155-5p前體高表達(dá)載體或miR-155-5p抑制劑表達(dá)載體，能較長(zhǎng)時(shí)間維持miR-155-5p在細(xì)胞內(nèi)的高水平或抑制狀態(tài)，以進(jìn)行miRNA功能獲得性或缺失性研究。miR-155-5p inhibitor對(duì)SiHa細(xì)胞的作用主要表現(xiàn)為G2/M期細(xì)胞比例增多，G2/M期阻滯使細(xì)胞無法進(jìn)入下一增殖周期，且呈非劑量依賴方式，這可能是其抗腫瘤機(jī)制的另一方面。另外，miR-155-5p對(duì)HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞周期和凋亡的影響不同，分析其差異的原因可能與miR-155-5p在HeLa細(xì)胞和SiHa細(xì)胞中的含量不同有關(guān)，前期研究發(fā)現(xiàn)miR-155-5p在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)要比HeLa細(xì)胞高。

miR-155-5p在宮頸癌患者組織、細(xì)胞和血清中表達(dá)的上調(diào)受上游哪些因素調(diào)控，以及下游調(diào)控哪些信號(hào)通路中的哪種靶基因是下一步重點(diǎn)研究方向。此次miR-155-5p與宮頸癌的相關(guān)性研究?jī)H為初步探討，樣本量較小，有待增加樣本量進(jìn)一步研究，為宮頸癌的早期診斷以及判斷miR-155-5p是否可能作為“癌基因”參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展提供更有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。