聶 靜， 王懿春， 黎祖榮， 董 靜

(湖南省腫瘤醫(yī)院/中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬腫瘤醫(yī)院ICU，湖南長(zhǎng)沙410013)

順鉑是一種廣泛應(yīng)用的抗癌藥物。但由于它是細(xì)胞周期非特異性藥物，無明確的靶向組織，不良反應(yīng)也較多。順鉑有嚴(yán)重的腎毒性，在臨床中常常引起急性腎功能衰竭。順鉑的腎毒性呈劑量依賴性［1］，因而限制了其臨床治療腫瘤的效果，但目前仍沒有有效且安全的藥物可以運(yùn)用于臨床，因此研究順鉑腎毒性產(chǎn)生的機(jī)制及尋找解決的方法成為了急需解決的課題。目前研究認(rèn)為其可能的機(jī)制包括:細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)以及活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生等［2］。近年來，順鉑誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞凋亡在其腎毒性中的作用逐漸引起了人們的重視，但具體機(jī)制仍不清楚。順鉑易于在腎臟外髓的近端小管上皮細(xì)胞，特別是S3段蓄積，從而引起急性腎功能衰竭，主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞凋亡［3－4］，同時(shí)伴有氧自由基的大量產(chǎn)生，使用抗氧化劑可以降低血尿素氮的水平［5］。我們之前的研究發(fā)現(xiàn)人腎小管上皮細(xì)胞株HK-2表達(dá)p66Shc，高葡萄糖和血管緊張素II均可引起HK-2細(xì)胞的p66Shc表達(dá)增加及磷酸化，并從胞漿向線粒體轉(zhuǎn)位，產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6］。因此本文旨在驗(yàn)證順鉑是否通過活化p66Shc-線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，為今后在臨床上研究如何降低順鉑腎毒性提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和新的靶分子。

材料和方法

1 主要試劑和儀器

順鉑(山東齊魯制藥廠);DMEM(Gibco);胎牛血清(杭州四季青公司);Bradford蛋白定量試劑盒(Bio-Rad);兔抗人 p66Shc抗體(Upstate Biotechnology);小鼠抗人β-actin抗體 (Santa Cruz);小鼠抗人phospho-p66Shc(Ser36)抗體(Abcam);辣根過氧化物酶Ⅱ抗(中杉金橋);PVDF膜、ECL試劑盒(Millipore);4000MM化學(xué)發(fā)光成像儀(Kodak);DCFHDA、MitoSOX Red和TUNEL(Invitrogen);激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM510)。

2 細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組

人源性近端腎小管上皮細(xì)胞株HK-2為本室保存。細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM(Sigma)，當(dāng)達(dá)到80%融合后，將細(xì)胞培養(yǎng)在含0．5%血清的培養(yǎng)基12 h，然后用不同濃度的順鉑(10 mg/L和20 mg/L)處理24 h，進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為3組，對(duì)照組:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDNA3．1的HK-2細(xì)胞;順鉑組:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDNA3．1的HK-2細(xì)胞給予順鉑作用24 h;順鉑+p66ShcS36A組:穩(wěn)定轉(zhuǎn)染p66ShcS36A(第36位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬膒66Shc)質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞給予順鉑作用24 h。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3．1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和建立穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株 HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)傳代。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)，更換為無血清培養(yǎng)基。按Lipofectamine(Invitrogen)說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染相關(guān)的質(zhì)粒。培養(yǎng)24 h后，更換含G418(Merk)800 mg/L，當(dāng)細(xì)胞大部分死亡時(shí)，換含200 mg/L G418的DMEM完全培養(yǎng)基。采用有限稀釋法進(jìn)行單克隆化，得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCDNA3．1或p66ShcS36A質(zhì)粒的HK-2細(xì)胞株。

3．2 激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞 ROS(DCFHDA)、線粒體ROS(MitoSOX Red)和凋亡(TUNEL)用DCFH-DA熒光染色法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的活性氧簇含量。DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH;而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。MitoSox Red是一種高選擇性的檢測(cè)線粒體ROS的熒光染料。它可自由透過活細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，并選擇性靶向于線粒體，被線粒體內(nèi)的超氧陰離子氧化產(chǎn)生紅色熒光。經(jīng)過順鉑處理后的HK-2細(xì)胞加入3．7%多聚甲醛室溫下固定20 min;搖床上用PBS洗3次，每次5 min;分別加入 DCFH-DA、MitoSOX Red和 TUNEL，DAPI復(fù)染核，室溫孵育15 min;搖床上用PBS洗3次，每次5 min;激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

3．3 細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt C)的含量檢測(cè) 收集細(xì)胞，于冰浴預(yù)冷的勻漿緩沖液400μL重懸，移入玻璃勻漿器冰浴中勻漿5 min，勻漿液于4℃、1 000 r/min離心10 min，共2次，取上清于4℃、12 000 r/min離心15 min，收集的上清即為不含細(xì)胞核和線粒體的胞漿成分。測(cè)定蛋白含量后進(jìn)行Western blotting分析。

3．4 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min，12 000 r/min離心15 min，取上清即為細(xì)胞總蛋白。用Bradford法檢測(cè)蛋白含量，取總蛋白20μg行Western blotting，上樣前樣品與SDS上樣緩沖液混合，于100℃煮沸3 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳(15%)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用封閉液25℃振蕩封閉0．5 h，然后與Ⅰ抗(抗 p66Shc1∶1 000、抗 phospho-p66Shc(Ser36)1∶1 000、抗 Cyt C 1∶200、抗 caspase-9 1∶200 和抗 βactin 1∶400)振蕩4℃孵育過夜，加相應(yīng)Ⅱ抗孵育1 h，ECL孵育4 min，4000MM化學(xué)發(fā)光成像儀成像、分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。應(yīng)用SPSS13．0軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析和LSD－t檢驗(yàn) ，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 順鉑對(duì)p66Shc和第36位絲氨酸磷酸化的p66Shc蛋白表達(dá)的影響

Western blotting結(jié)果顯示，順鉑處理后p66Shc蛋白表達(dá)無明顯改變，但第36位絲氨酸磷酸化的p66Shc蛋白表達(dá)增加，且隨著順鉑濃度升高表達(dá)逐漸增加(P＜0．01)，見圖1。這說明順鉑誘導(dǎo) p66Shc第36位絲氨酸磷酸化。

Figure 1．Effects of cisplatin on the protein expression of p66Shc and p-p66Shc in HK-2 cells．Mean ± SD．n=3．＊＊P ＜0.01 vs 0 mg/L;#P ＜0．05 vs10 mg/L．圖1 順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞 p66Shc及第36位絲氨酸磷酸化的p66Shc蛋白表達(dá)的影響

2 p66Shc對(duì)順鉑促凋亡作用的影響

如圖2所示，對(duì)照組僅見少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞(TUNEL探針標(biāo)記)，順鉑組細(xì)胞凋亡明顯增加，可見細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，染色加深，與順鉑組比較，p66ShcS36A組凋亡細(xì)胞顯著減少。這說明順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞凋亡，而第36位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬膒66Shc可以抑制順鉑的促凋亡作用。

3 p66Shc對(duì)順鉑促活性氧產(chǎn)生的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，順鉑組細(xì)胞ROS(DCFH-DA探針標(biāo)記)及線粒體ROS(MitoSOX Red探針標(biāo)記)含量均明顯增加;與順鉑組比較，順鉑+p66ShcS36A組細(xì)胞ROS及線粒體ROS含量均明顯減少，表明順鉑促進(jìn)細(xì)胞和線粒體ROS產(chǎn)生，而第36位絲氨酸突變?yōu)楸彼岬膒66Shc可以抑制順鉑的促活性氧產(chǎn)生的作用。

Figure 2．Effects of p66Shc S36A on cisplatin－induced production of cellular ROS，mitochondrial ROSand apoptosis in HK-2 cells．Mean ± SD．n=3．＊＊P ＜ 0．01 vs control;##P ＜0．01 vs cisplatin．圖2 p66Shc S36A對(duì)順鉑誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞ROS、線粒體ROS產(chǎn)生及細(xì)胞凋亡的影響

4 p66Shc對(duì)順鉑誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

如圖3所示，順鉑處理后，Cyt C釋放增加，caspase-9蛋白表達(dá)也增加(P＜0．01)，p66ShcS36A能阻斷順鉑的上述作用，與順鉑組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0．05)。

Figure 3．Effects of p66Shc S36A on the expression of apoptosis mitochondrial signal transduction pathway－related proteins in HK-2 cells treated with cisplatin．Mean±SD．n=3．＊＊P ＜0．01 vs control;##P ＜0．01 vs cisplatin．圖3 p66Shc S36A對(duì)順鉑誘導(dǎo)的線粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

討 論

線粒體是順鉑重要的作用靶點(diǎn)［7－8］，順鉑易于在腎臟的近端小管上皮細(xì)胞蓄積可能與其在線粒體積聚有關(guān)［9］。大量研究證實(shí)，順鉑導(dǎo)致腎臟損傷的同時(shí)伴有氧自由基的大量產(chǎn)生及腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，而上述改變與線粒體的損害關(guān)系極為密切［10］。p66Shc是哺乳動(dòng)物生命周期相關(guān)的蛋白酶，也是近年來研究細(xì)胞氧化應(yīng)激的主要蛋白酶之一。它通過在線粒體內(nèi)氧化細(xì)胞色素C產(chǎn)生大量H2O2導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，最終引起細(xì)胞凋亡［11］。研究表明，抗腫瘤物質(zhì)萊菔硫烷(D，L-sulforaphane)致人乳腺癌細(xì)胞凋亡的作用正是通過p66Shc調(diào)節(jié)線粒體ROS的產(chǎn)生來實(shí)現(xiàn)的［12］?；谝陨涎芯?，我們認(rèn)為順鉑導(dǎo)致的p66Shc介導(dǎo)的線粒體ROS的大量產(chǎn)生可能是導(dǎo)致腎小管細(xì)胞凋亡和腎功能受損的主要原因。

首先，我們觀察了順鉑對(duì)p66Shc表達(dá)、活性的影響，發(fā)現(xiàn)順鉑處理后，p66Shc蛋白的表達(dá)無明顯變化。有研究認(rèn)為，第36位絲氨酸(Ser36)是p66Shc介導(dǎo)氧化應(yīng)激相關(guān)損傷的關(guān)鍵活化位點(diǎn)［13］。p66Shc主要定位于胞漿，小部分(10% ～40%)與線粒體熱休克蛋白(mHSP70)及線粒體內(nèi)、外膜轉(zhuǎn)移酶(TIM/TOM)形成復(fù)合物，定位于線粒體膜間隙［14］。在正常情況下，p66Shc是失活的，不影響線粒體的功能，只有在某些信號(hào)(p53/H2O2/glucose等)的作用下，胞漿內(nèi)的p66ShcSer36發(fā)生磷酸化，磷酸化的p66Shc可被脯氨酰異構(gòu)酶PIN1識(shí)別從而異構(gòu)化，然后在蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A，PP2A)的作用下去磷酸化進(jìn)入線粒體，并最終在線粒體氧化Cyt C產(chǎn)生ROS［13］。因此，我們進(jìn)一步檢測(cè)了順鉑對(duì)HK-2細(xì)胞p66ShcSer36磷酸化的影響，發(fā)現(xiàn)順鉑作用后磷酸化的p66Shc(Ser36)蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組，且隨著順鉑濃度增大，表達(dá)增加。說明順鉑誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞p66ShcSer36磷酸化，可能在順鉑導(dǎo)致的細(xì)胞氧化損傷及凋亡中起重要作用。

Ser36是p66Shc活化的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)，當(dāng)其突變?yōu)楸彼?S36A)后，p66Shc介導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷明顯減輕［13，15］。為了進(jìn)一步研究 p66Shc在順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化損傷中的作用機(jī)制，我們將表達(dá)p66ShcS36A的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)p66ShcS36A可以明顯減輕順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和氧化損傷。與順鉑組比較，轉(zhuǎn)染p66ShcS36A可以抑制細(xì)胞凋亡，減少細(xì)胞和線粒體ROS的產(chǎn)生，減少細(xì)胞色素C釋放，下調(diào)caspase-9蛋白表達(dá)。上述結(jié)果提示Ser36磷酸化在順鉑誘導(dǎo)的線粒體凋亡途徑中起重要作用。我們推測(cè)在順鉑的作用下，通過磷酸化p66ShcSer36，在線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，ROS導(dǎo)致線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，使線粒體膜通透性下降，從而釋放細(xì)胞色素 C，激活胞漿內(nèi)的caspase-9，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，上述途徑與p66Shc在H2O2等促凋亡信號(hào)作用下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基本一致［11，13］。

綜上所述，順鉑通過誘導(dǎo)p66ShcSer36磷酸化，使p66Shc轉(zhuǎn)位至線粒體，在線粒體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，激活線粒體凋亡通路誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞凋亡。