夏 珍， 李菊香， 丁 浩， 孫國芳， 洪 葵， 吳延慶， 程曉曙

(南昌大學第二附屬醫(yī)院心內科，江西省分子醫(yī)學重點實驗室，江西南昌330006)

唯BH3蛋白Bim(Bcl-2-interacting mediator of cell death)是Bcl-2家族中BH3-only亞家族的成員，僅有1個BH3同源結構域，是一種重要的凋亡調節(jié)蛋白。Bim廣泛分布于機體各種組織中，與調節(jié)細胞凋亡的功能密切相關，具有促凋亡的活性。Bim的促凋亡活性受到嚴格調控，涉及多種信號通路。有研究表明，Bim蛋白通過磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，PKB/Akt)、絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activitied protein kinase kinase，MEK)/細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路促進非小細胞癌的凋亡［1］。在Tan等［2］的研究中，利用慢病毒載體敲除bim基因，可通過Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)信號通路抑制海洛因介導的神經細胞凋亡，表明Bim可通過JNK途徑發(fā)揮促細胞凋亡作用。

近年來內質網凋亡信號通路越來越引人注目，內質網是真核細胞中蛋白質翻譯合成的場所，是細胞內的鈣庫，而鈣參與了眾多細胞信號轉導通路［3-4］。低血糖、缺氧、毒素等因素均能干擾內質網功能，使內質網蛋白大量合成從而導致蛋白錯誤折疊或過度負荷［5-6］。適當程度的內質網應激如分子伴侶的表達尚能保護細胞避免損傷，而過度內質網應激時，保護機制不能與損傷相抗衡，則會激活三磷酸肌醇/鈣 (inositol 1，4，5-triphosphate/Ca2+，IP3/Ca2+)通道蛋白、c/EBP同源蛋白(c/EBP homologous protein，CHOP)和caspase-12的表達而誘導細胞凋亡［7］。最近發(fā)現(xiàn)Bcl-2家族中的一些成員在內質網中也有分布，并發(fā)揮促凋亡或抗凋亡作用。那么，在缺氧致心肌細胞損傷時，內質網又是如何參與這一過程，作為Bcl-2家族的唯BH3蛋白Bim又是怎樣調節(jié)內質網這一凋亡途徑的呢，值得進一步研究證實。

因此，本研究將Bim-siRNA轉染心肌細胞沉默bim的表達，并給與缺氧處理，觀察心肌細胞凋亡及內質網應激標志分子的表達情況，探討內質網應激在Bim介導缺氧致心肌細胞凋亡中的作用。為臨床防治心肌缺血缺氧損傷提供理論和實驗依據(jù)，對研發(fā)新的保護心肌的藥物作用分子靶點具有重要意義和廣闊的前景。

材料和方法

1 材料

1．1 動物 出生1～3 d Sprague-Dawley大鼠，由南昌大學醫(yī)學院實驗動物科學部提供。

1．2 試劑 培養(yǎng)基DMEM和胎牛血清購自Hy-Clone;MTT細胞活性檢測試劑盒購自 Ameresco。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物有限公司?？偟鞍滋崛≡噭┖匈徸云绽R基因技術有限公司。脂質體LipofectamineTM2000和BimsiRNA 購自 Invitrogen。I抗 Bim、IP3、caspase-12 及β-actin購自Santa Cruz。II抗辣根過氧化物酶IgG購自北京中杉金橋公司。

2 方法

2．1 原代心肌細胞培養(yǎng)及鑒定 取出生1～3 d乳鼠心臟，用含雙抗(青霉素+鏈霉素)的磷酸鹽緩沖液清洗3次，剝除筋膜、脂肪等多余組織，用剪刀將心臟剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的組織，用0.08%胰酶和1．00%Ⅱ型膠原酶消化組織，離心收集細胞以15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基充分重懸，200目濾網過濾細胞懸液至培養(yǎng)皿，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，經差速貼壁2 h，使成纖維細胞貼壁。然后小心吸出未貼壁心肌細胞懸液接種到放有蓋玻片的培養(yǎng)皿中，加入0．1%BrdU抑制成纖維細胞的增殖。24 h后第1次換液，48 h后取出玻片，用37℃ PBS漂洗，4%甲醛固定，加大鼠抗α-橫紋肌肌動蛋白單克?、窨?∶50，于4℃濕盒過夜，加FITC羊抗小鼠IgG 1∶50，孵育30 min，緩沖鹽水洗2次，DAPI封片劑染核，顯微鏡下觀察。

2．2 缺氧模型的建立及轉染 配置模擬缺氧溶液，以95%N2、5%CO2預飽和1 h，置換正常培養(yǎng)基，放入缺氧盒中通95%N2、5%CO230 min后密閉缺氧盒，放置于37℃孵箱中缺氧。我們通過前期實驗，發(fā)現(xiàn)Bim在心肌細胞缺氧12 h表達最高。將Bim-siRNA和陰性對照siRNA通過脂質體轉染乳鼠心肌細胞。按操作說明用不含血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋適當量的LipofectamineTM2000和Bim-siRNA混合形成轉染試劑混合液，加入心肌細胞密度為90% 的6孔板中，輕輕搖晃混合。在5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后換有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。轉染48 h后，將心肌細胞置于缺氧盒中缺氧12 h。實驗分為5組:(1)正常對照組;(2)缺氧組;(3)缺氧+陰性對照siRNA組;(4)缺氧+脂質體組;(5)缺氧+Bim-siRNA組。Invitrogen公司設計合成了3對Bim-siRNA序列，將3對Bim-siRNA轉染心肌細胞，篩選沉默效率最高的Bim-siRNA用于后續(xù)實驗。siRNA-1上游引物5’-AACAGAUGUAAGUUAACGAUUUCCG-3’，下游引物5’-UGGUCAAUACUACAUGUGAUACCUU-3’。 siRNA-2上 游 引 物 5’-AACAGUUGUAAGAUAACCAUUUGCG-3’，下游引物 5’-CGCAAAUGGUUAUCUUACAACUGUU-3’。siRNA-3 上游引物 5’-ACAGAUUGUAGAUACAACAUUUGCG-3’，下游引物 5’-CAUGGUUCGUAAUACAACUGACUUU-3’。陰性對照序列上游引物5’-GUCCUCGACCUAGUUACGUTT-3’，下游引物5’-UCUAGACACAGUCGGAGAGTT-3’。

2．3 MTT法測定細胞活性 取96孔板種植細胞，種密度為1×105cells/well，空白孔加不含細胞的培養(yǎng)液(每組4孔)。經實驗干預后，每孔加入20μL MTT溶液(5 g/L)，避光，繼續(xù)溫育4 h，小心吸棄上清，終止培養(yǎng)，然后加入150μL DMSO，搖床震搖15 min，使結晶充分溶解，酶標儀讀取492 nm處吸光度(A)，實驗結果以細胞活性表示。細胞活性(%)=處理組A值/對照組A值×100%。

2．4 流式細胞術檢測細胞凋亡率 轉染48 h、缺氧12 h后用胰酶消化收集各組細胞。按Annexin VFITC試劑盒提供的操作說明，主要步驟為:用胰酶消化收集細胞，PBS洗滌細胞 2次，加入 500μL Binding Buffer重懸細胞，分別加入 Annexin V-FITC及PI各5μL混勻，室溫避光反應5～15 min后，在1 h內進行流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率。

2．5 流式細胞術檢測細胞內鈣離子濃度 轉染48 h、缺氧12 h后用胰酶消化收集各組細胞。按Fluo-3 AM(鈣離子熒光探針)試劑盒提供的操作說明，主要步驟為:用500μL HEPES緩沖液重懸細胞，取1μL Fluo-3 AM溶液加入細胞懸液中(Fluo-3 AM常用濃度為0．5～5 mmol/L)，在37℃、5%孵箱中孵育60 min進行熒光探針裝載，HEPES緩沖液洗滌后再孵育20～30 min，已確保Fluo-3 AM在細胞內完全轉變成Fluo-3。之后進行流式細胞術檢測各組細胞內鈣離子濃度。以平均熒光強度(mean fluorecence intensity)反映細胞內游離Ca2+濃度。

2．6 Western blotting檢測各蛋白的表達水平 取各組原代心肌細胞，根據(jù)總蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，用全自動生化分析儀(Beckman)測定蛋白質濃度。根據(jù)蛋白濃度取適量進行SDS-PAGE分離蛋白。將蛋白轉移到硝酸纖維素膜后，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST中搖床上封閉2 h，用TBST洗膜10 min，共3 次，分別用 Bim、caspase-12、IP3和 β-actin的I抗按適當比例4℃孵育過夜，再洗膜3次，加入辣根過氧化物酶標記的抗兔IgG孵育2 h，最后洗膜3×10 min，進行顯色，膠片曝光，結果用LabWork 3．0 軟件(UVP Inc．)，以目的條帶/β-actin 的灰度值進行分析。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù) ±標準差(mean±SD)表示，采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件包分析，多組間比較采用方差分析，組間分析采用q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 原代心肌細胞的成功培養(yǎng)及鑒定

于倒置顯微鏡下觀察，心肌細胞呈放射狀，不規(guī)則三角形、梭形，并伸出偽足相互接觸交織成網，呈片狀有節(jié)律搏動。免疫組化法結果顯示，α-橫紋肌肌動蛋白抗體陽性的心肌細胞胞漿內可見棕色顆粒，見圖1。

Figure 1．The morphological identification of cardiomyocytes．A:inverted microscopy(×40);B:immunohistochemical staining forα-striated muscle actin(×200)．圖1 心肌細胞形態(tài)學鑒定

2 siRNA轉染心肌細胞

將脂質體LipofectamineTM2000與帶有綠色熒光蛋白報告基因的陰性對照siRNA序列轉染入心肌細胞后，在熒光顯微鏡下可觀察到細胞中綠色熒光蛋白的表達，而未轉染陰性對照siRNA序列的細胞則未見綠色熒光，這表明陰性對照siRNA序列轉染成功，見圖2。

Figure 2．The result of fluorescence microscopy for detecting green fluorescence in cardiomyocytes(×200)．A:inverted microscopy;B:blank control group;C:hypoxia+negative control siRNA group．圖2 熒光顯微鏡檢測心肌細胞中的綠色熒光

3 篩選有效Bim-siRNA

與陰性對照siRNA組比較，3對Bim-siRNA均能顯著降低Bim的表達，其中以第2對沉默效率最高(P ＜0．01)，其沉默效率達86．73%，見圖 3。

4 缺氧對心肌細胞活性和凋亡率的影響及BimsiRNA的作用

與空白對照組比較，缺氧組細胞活性明顯降低(P＜0.05)，細胞凋亡率明顯增高(P＜0．01);而Bim-siRNA轉染后，心肌細胞活性明顯增加(P＜0.05)，細胞凋亡率明顯下降(P＜0．01)，而陰性對照siRNA組則于缺氧組無明顯差異，見圖4、表1。這說明通過RNA干擾下調Bim表達能抑制缺氧導致心肌細胞的凋亡。

5 Bim-siRNA轉染和缺氧對心肌細胞鈣離子的影響

因Fluo-3與鈣離子結合產生的熒光強度與鈣離子濃度成正比，故以平均熒光強度反映細胞內游離Ca2+濃度。檢測不同條件干預后心肌細胞內鈣離子熒光強度結果顯示，缺氧組鈣離子熒光強度顯著高于對照組(P＜0.05)，說明缺氧損傷后細胞內鈣離子濃度增加;Bim-siRNA轉染組鈣離子熒光強度較缺氧+陰性對照siRNA組明顯降低，而缺氧+陰性對照siRNA組則與缺氧組無明顯差異，見圖5。這說明通過RNA干擾下調Bim表達能抑制缺氧導致鈣離子濃度增加的作用。

Figure 3．The effect of siRNA on expression of Bim．A:blank control group;B:hypoxia+liposome group;C:hypoxia+negative control siRNA group;D:hypoxia+siRNA-1 group;E:hypoxia+siRNA-2 group;F:hypoxia+siRNA-3 group．Mean ±SD．n=8．##P ＜0．01 vs C．圖3 Bim-siRNA轉染心肌細胞對Bim表達的影響

Figure 4．The changes of apoptotic rate of cardiomyocytes treated with Bim-siRNA transfection and hypoxia．A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+Bim-siRNA group．圖4 Bim-siRNA轉染和缺氧對心肌細胞凋亡率的影響

表1 Bim-siRNA轉染和缺氧后心肌細胞活性和凋亡率的變化Table 1．The changes of activity and apoptotic rate of cardiomyocytes treated with Bim-siRNA transfection and hypoxia(%．Mean±SD．n=8)

6 Bim-siRNA轉染和缺氧對心肌細胞caspase-12和IP3表達的影響

Western blotting結果顯示，與空白對照組比較，缺氧干預后，心肌細胞內內質網標志分子caspase-12(0．840 ±0．037 vs 0．150 ±0．029，P ＜0.05)和 IP3(0．700 ±0．034 vs 0．140 ±0．029，P ＜0.05)的表達明顯增加，而通過Bim-siRNA轉染下調Bim表達后，能抑制缺氧導致的這一作用(P＜0.05 or P＜0．01)，見圖6。這說明Bim-siRNA轉染能顯著降低Bim的表達，同時使內質網應激標志分子caspase-12和IP3的表達降低。

Figure 5．The changes of calcium fluorescence intensity of cardiomyocytes treated with Bim-siRNA transfection and hypoxia．A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+Bim-siRNA group．Mean±SD．n=8．*P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05 vs C．圖5 Bim-siRNA轉染和缺氧對心肌細胞內鈣離子熒光強度的影響

討 論

缺氧是一種應激因素，是臨床上最常見的病理過程之一，也是引起細胞損傷，進而影響機體的功能活動的常見原因。有研究報道，在心肌缺氧損傷時，可導致心室收縮和舒張功能明顯下降，左心功能障礙，嚴重時導致心力衰竭，其機制可能與心肌細胞內鈣超載、氧自由基大量生成有關［8］。本研究結果也發(fā)現(xiàn)，心肌細胞缺氧培養(yǎng)時，在觀察到細胞凋亡增加的同時，細胞存活率與對照組比較明顯升高，進一步表明心肌細胞受缺氧損傷。而鈣離子濃度比對照組明顯升高，闡明鈣離子超載可能參與了細胞損傷的過程，但其具體機制尚待進一步研究。

Qian等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠心肌梗死模型中，通過抑制Bim蛋白的表達，拮抗Bim的促凋亡作用，發(fā)揮細胞保護作用。研究表明，瑞舒伐他汀可降低促凋亡蛋白Bim表達，減少心肌細胞凋亡，改善心肌梗死后的療效［10］。綜上所述，Bim蛋白具有促細胞凋亡作用，而且與心肌細胞凋亡有密切聯(lián)系。在本研究中，當心肌細胞缺氧時，心肌細胞發(fā)生凋亡，細胞活性下降，Bim蛋白表達升高。而利用小干擾RNA技術沉默bim的表達可逆轉缺氧導致的這一作用，使心肌細胞凋亡率減少，細胞活性增加。這表明Bim在缺氧導致心肌細胞凋亡的過程中起著重要的作用。

內質網應激是一條新發(fā)現(xiàn)的細胞凋亡信號轉導通路。近年來有研究報道，內質網應激與高血壓、心肌肥厚、心肌纖維化、心肌梗死、心臟衰竭有關［11-14］。Lakshmanan等［15］研究中發(fā)現(xiàn)，內質網應激在糖尿病引起心肌細胞凋亡的過程中起了重要作用。內質網應激介導細胞凋亡，其中一個重要因素是caspase-12，位于內質網胞漿面，過度內質網應激可激活caspase-12，而非內質網應激則不能激活caspase-12。這在以后的研究也得到證實［16-17］。在大鼠心肌梗死模型中，Weng等［18］報道以促紅細胞生成素處理大鼠心肌細胞，抑制caspase-12活化，使其表達降低，細胞凋亡下降，進而保護心肌細胞。在離體大鼠心肌缺血再灌注損傷模型中，通過免疫組化檢測caspase-12的表達，Liu等［19］發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷觸發(fā)心肌細胞內質網應激，caspase-12表達升高與心肌細胞凋亡明顯相關。IP3受體(IP3receptor，IP3R)有3種亞型，即I、II、III亞型。在發(fā)生內質網應激的細胞中，IP3R I的活化介導細胞內鈣離子釋放增加，導致細胞凋亡。而這一作用可被小干擾RNA沉默IP3R I所抑制。研究發(fā)現(xiàn)，抑制內質網應激，降低Bim蛋白的表達，可減少成纖維細胞的凋亡［20］。在小鼠神經母細胞瘤中，超氧化物歧化酶1基因突變可導致內質網應激和細胞凋亡，而敲除bim基因可抑制這一作用［21］。而關于Bim通過內質網途徑介導心肌細胞凋亡的相關研究在國內外未見報道。本研究心肌細胞缺氧時，內質網標志分子 caspase-12、IP3表達升高，心肌細胞凋亡增加，存活率下降，說明缺氧損傷觸發(fā)了內質網應激，進而誘導心肌細胞凋亡;而沉默bim的表達，可以下調caspase-12和IP3的表達，心肌細胞凋亡減少，存活率增加。這進一步證明下調Bim的表達可抑制缺氧導致的心肌細胞凋亡的作用，同時也說明Bim可能通過內質網途徑介導缺氧致心肌細胞損傷。

綜上所述，沉默bim的表達可抑制缺氧導致的心肌細胞凋亡的作用，進而發(fā)揮心肌保護作用，其機制可能與內質網信號通路有關，為以心肌細胞凋亡為基礎的心血管疾病的治療提供一種可能的治療方向。

Figure 6．The changes of caspase-12 and IP3 levels in cardiomyocytes treated with Bim-siRNA transfection and hypoxia．A:blank control group;B:hypoxia group;C:hypoxia+liposome group;D:hypoxia+negative control siRNA group;E:hypoxia+Bim-siRNA group．Mean ±SD．n=8．*P ＜0.05 vs A;#P ＜0.05，##P ＜0．01 vs C．圖6 Bim-siRNA轉染和缺氧后心肌細胞caspase-12和IP3表達的變化