惠 毅，楊 宇，唐洪屈，王寶家，鄭秀麗，周新穎

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，成都 610075)

本實(shí)驗(yàn)研究從“肺病及腸”角度出發(fā)，建立“肺病”(慢性支氣管炎)動(dòng)物模型，分別選取三個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)，觀察肺病大鼠胃腸功能、肺與結(jié)腸組織VIP、SP表達(dá)的變化，探尋“肺”與“大腸”在胃腸動(dòng)力方面共同的物質(zhì)基礎(chǔ)和“肺病及腸”病理傳變機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量140±20g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司(動(dòng)物合格證號(hào)scxk(川)2008-24)。

1.2 藥物及試劑

天下秀香煙，川渝中煙工業(yè)公司，焦油含量12mg;水合氯醛，江蘇省昆山市石浦年沙助劑廠(批號(hào)080120);粉狀活性炭分析純，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司(批號(hào)HG/T3491-1999);羧甲基纖維素鈉(PH6)，瀘州北方醫(yī)藥輔料有限公司(批號(hào)8020110);VIP(SP)免疫組化試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司(批號(hào)BAO134(BAO126))。

1.3 儀器及設(shè)備

電子稱重天平(ACS-3H型)，廣州中山市金利電子衡器發(fā)有限公司生產(chǎn);光學(xué)顯微鏡(日本OlympusBX50型顯微鏡);石蠟切片機(jī)(LEICARM2245)，德國(guó) Leica;包埋機(jī)(BMJ-III)，常州中威電子儀器;病理組織漂烘處理儀(DHY-III)，常州中威電子儀器;生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(BL-420F型)，成都泰盟科技有限公司;遠(yuǎn)紅外快速恒溫干燥箱(型號(hào) YHG-40X45-S)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;免疫組化圖像分析軟件(IMAGE-PRO PLUS 6.0)。

2 方法

2.1 分組及模型的制備

取雄性體質(zhì)量180～220g健康 SD大鼠共60只，按體重隨機(jī)分成空白組(24只)和模型組(36只)。所有大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng) 1周后，自制550mm×330mm×390mm的煙熏箱(規(guī)格根據(jù)鋼絲籠大小而確定)，頂部對(duì)角留2個(gè)2mm×3mm的通氣孔，將模型組大鼠分別裝入鋼絲籠內(nèi)，每籠12只。自制四面封閉的立方形玻璃器皿，其內(nèi)放置鐵絲網(wǎng)，香煙每份8支，點(diǎn)燃后分別放置于鋼絲網(wǎng)上，將裝入大鼠的鋼絲籠放置于玻璃器皿上，并將煙熏箱罩于鋼絲籠外，15min后放置第二批香煙，每次煙熏50min，每天3次(分別在早上9點(diǎn)、下午2點(diǎn)和6點(diǎn))，共煙熏70d。空白組大鼠置于無(wú)煙環(huán)境中飼養(yǎng)。

2.2 標(biāo)本采集與檢測(cè)方法

2.2.1 胃腸功能檢測(cè)方法 包括糞便含水率、胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率。分別在造模第19、49、69天收集各組大鼠24h糞便顆粒，稱重后并予以記錄，將稱濕重后的糞便置于60℃遠(yuǎn)紅外線快速恒溫干燥箱中干燥10h，稱重并予以記錄。大鼠禁食24h，分別在造模第20、50、70天分別隨機(jī)抽取空白對(duì)照組8只和模型組大鼠10只，用5%炭末與10%羧甲基纖維素鈉制成懸混液［1］，各組大鼠以20ml·kg－1的劑量灌胃，30 min后以2.4%水合氯醛1.2～1.4 ml/100g腹腔注射麻醉，仰臥位固定于手術(shù)板，打開(kāi)腹腔取全胃，沖洗后稱胃全重，清除胃內(nèi)容物后稱胃空重;分離腸系膜，剪取幽門(mén)至回盲部的腸管，不加牽引地平鋪于玻璃板上，測(cè)其全長(zhǎng)和炭末前沿至幽門(mén)的距離。

2.2.2 VIP、SP表達(dá)檢測(cè)方法 大鼠禁食24h，在造模第20、50、70天分別隨機(jī)抽取空白對(duì)照組8只和模型組大鼠10只，以2.4%水合氯醛1.2～1.4 ml/100g腹腔注射麻醉后，剖開(kāi)胸腹取肺、結(jié)腸組織，10%甲醛固定3d后進(jìn)行免疫組化相關(guān)檢測(cè)，具體方法參見(jiàn)試劑說(shuō)明書(shū)。各組大鼠肺、結(jié)腸組織染色后的切片在OLYMPUS BX50型光學(xué)顯微鏡和Mias-2000型圖形分析系統(tǒng)下用200倍物鏡選取3個(gè)不同的視野進(jìn)行拍照，用計(jì)算機(jī)圖像分析軟件(IMAGE-PRO PLUS 6.0)對(duì)拍好的照片進(jìn)行半定量分析。測(cè)定其累積積分光密度(IOD)，對(duì)每張切片的3個(gè)IOD求平均值并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)方法

3 結(jié)果

4 討論

《疫疹一得》有云:“肺氣不能下達(dá)，則大腸不得傳道之令，而大便亦結(jié)矣?！北忝厥欠尾髯兊健澳c”的最為常見(jiàn)的病癥，其發(fā)生機(jī)制主要有腸道動(dòng)力障礙和腸道水分過(guò)度吸收［2，3］。胃腸功能(包括胃內(nèi)殘留率、小腸推進(jìn)率)是檢測(cè)胃腸動(dòng)力的重要指標(biāo)，當(dāng)胃腸動(dòng)力降低時(shí)，表現(xiàn)為胃殘留率升高和(或)小腸推進(jìn)率降低，提示胃及小腸的蠕動(dòng)功能和消化功能降低［4］。糞便含水率則可間接反映腸道水分吸收情況。表1～表3顯示，與空白組比較，在造模第50、70天，模型組大鼠糞便含水率降低(P＜0.01);在造模第20、50、70天胃內(nèi)殘留率升高，小腸推進(jìn)率降低(P＜0.01)，表明模型組大鼠胃腸蠕動(dòng)功能降低，腸道水分過(guò)分吸收，存在不同程度的便秘情況，即肺病傳變到“腸”。

表1 肺病大鼠第20、50、70天糞便含水率測(cè)定結(jié)果比較(±s)

表1 肺病大鼠第20、50、70天糞便含水率測(cè)定結(jié)果比較(±s)

注:空白組與模型組比較:★P ＜0.05，★★P ＜0.01;模型組間與第20天比較:△ ＜0.05，△△P ＜0.01;與第50天比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組 別 只數(shù) 第20天 第50天 第70天8 0.63±0.09 0.66±0.04 0.63±0.02模型組 10 0.62±0.03 0.49±0.06★★△△ 0.44±0.04空白組★★△△▲

表2 肺病大鼠第20、50、70天胃內(nèi)殘留率測(cè)定結(jié)果比較(±s)

表2 肺病大鼠第20、50、70天胃內(nèi)殘留率測(cè)定結(jié)果比較(±s)

注:空白組與模型組比較:★P ＜0.05，★★P ＜0.01;模型組間與第20天比較:△ ＜0.05，△△P ＜0.01;與第50天比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組 別 只數(shù) 第20天 第50天 第70天8 0.32±0.03 0.36±0.01 0.37±0.02模型組 10 0.43±0.03★★ 0.46±0.04★★△ 0.52±0.03空白組★★△△▲▲

表3 肺病大鼠第20、50、70天小腸推進(jìn)率測(cè)定結(jié)果比較(±s)

表3 肺病大鼠第20、50、70天小腸推進(jìn)率測(cè)定結(jié)果比較(±s)

注:空白組與模型組比較:★P ＜0.05，★★P ＜0.01;模型組間比較:與第20天比較:△ ＜0.05，△△P ＜0.01;與第50天比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組 別 只數(shù) 第20天 第50天 第70天8 0.85±0.04 0.86±0.04 0.85±0.04模型組 10 0.73±0.05★★ 0.65±0.04★★△△ 0.57±0.03空白組★★△△▲▲

表4 肺病大鼠第20、50、70天肺、結(jié)腸組織VIP表達(dá)結(jié)果比較(±s，IOD)

表4 肺病大鼠第20、50、70天肺、結(jié)腸組織VIP表達(dá)結(jié)果比較(±s，IOD)

注:空白組與模型組比較:★P ＜0.05，★★P ＜0.01;模型組間與第20天比較:△ ＜0.05，△△P ＜0.01;與第50天比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組 別 只數(shù) 第20天 第50天 第70天2±2153.40結(jié) 腸 組 織 28731.70±3144.21 29490.37±2273.57 29292.59±1077.78模型組 10 肺 組 織 20490.31±1346.00★ 21875.56±1601.37★★△ 23327.36±1243.36★★△△▲結(jié) 腸 組 織 10345.49± 892.46★★ 10848.62± 940.09★★ 11324.99± 674.09空白組 8 肺 組 織 18027.23±3179.77 17970.17±2589.63 18566.6★★△

表5 肺病大鼠第20、50、70天肺、結(jié)腸組織 SP表達(dá)結(jié)果比較(±s，IOD)

表5 肺病大鼠第20、50、70天肺、結(jié)腸組織 SP表達(dá)結(jié)果比較(±s，IOD)

注:空白組與模型組比較:★P ＜0.05，★★P ＜0.01;模型組間與第20天比較:△ ＜0.05，△△P ＜0.01;與第50天比較:▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01

組 別 只數(shù) 第2 0天 第50天 第70天空白組 8 肺 組 織 18566.62±2153.40 17970.17±2589.63 18027.23±3179.77結(jié) 腸 組 織 22969.07±2798.74 21905.61±2634.88 21845.78±2222.31模型組 10 肺 組 織 20470.31±1317.81★ 21875.56±1601.37★★△ 22627.36±1497.68★★△△結(jié) 腸 組 織 24721.20±1902.33 25128.61±2228.11★ 27685.99±3583.65★★△▲

圖1 模型組肺組織VIP表達(dá)(HE×200)

圖2 模型組結(jié)腸組織VIP表達(dá)(HE×200)

圖3 模型組肺組織SP表達(dá)(HE×200)

圖4 模型組結(jié)腸組織SP表達(dá)(HE×200)

慢性支氣管炎是以淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主兼有中性粒細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞參與的氣道炎癥。VIP能抑制 IL-6、TNF-α、IL-8、IL-2 等炎性因子和趨化因子的表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子 IL-10的生成［5］;SP能誘導(dǎo)白細(xì)胞粘附、浸潤(rùn)，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，還具有調(diào)節(jié)TNF-α、IL-8等細(xì)胞因子產(chǎn)生的作用，從而擴(kuò)大炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)［6］;可知 VIP、SP均參與了慢性支氣管炎的發(fā)病機(jī)制。VIP、SP廣泛存在于胃腸道，VIP主要參與大小腸的舒張，可松弛胃腸平滑肌，抑制小腸及結(jié)腸環(huán)形括約肌收縮［7］。SP為胃腸感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的興奮性遞質(zhì)，可引起腸運(yùn)動(dòng)明顯增強(qiáng)［8］，二者相互協(xié)同，共同完成腸道蠕動(dòng)功能。VIP、SP這種功能與中醫(yī)理論所論述大腸“傳導(dǎo)之官”的功能相類似，而大腸的傳導(dǎo)功能則有賴于肺的宣發(fā)肅降，正所謂“肺氣不能下達(dá)，則大腸不得傳道之令，而大便亦結(jié)矣”。據(jù)此可推測(cè)，中醫(yī)所說(shuō)肺失宣降而致的便秘，其病理機(jī)制可能與 VIP、SP密切相關(guān)。表4、表5顯示，與空白組比較，模型組大鼠造模第20、50、70天肺組織 VIP、SP表達(dá)升高(P＜0.05或 P＜0.01)，結(jié)腸組織 VIP表達(dá)降低(P＜0.01);造模第50、70天結(jié)腸組織 SP表達(dá)升高(P＜0.05或 P＜0.01)。此結(jié)果表明，在肺病狀態(tài)下大鼠結(jié)腸組織VIP、SP均出現(xiàn)表達(dá)變化。據(jù)上述文獻(xiàn)可知，VIP、SP直接影響到腸道的傳導(dǎo)功能，出現(xiàn)便秘的病理表現(xiàn)，證實(shí)肺病傳變到“腸”。另一方面，VIP具有抑制胃酸和胃蛋白酶分泌、刺激水和碳酸氫鹽分泌等功能［7］。SP能刺激小腸、結(jié)腸黏膜分泌水和電解質(zhì)，促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)作用［9～12］，二者相互協(xié)同使腸道中水分保持在一定水平，不至于太過(guò)而泄瀉或不足而便秘。VIP、SP這種功能與中醫(yī)理論所論述“大腸主津”、“小腸主液”功能相類似，而大腸津液的輸布功能有賴于肺的通調(diào)水道。正如《素靈微蘊(yùn)·卷四》所言:“肺與大腸表里同氣，肺氣化津，滋灌大腸，則腸滑而便易。”因此，中醫(yī)所說(shuō)的肺失通調(diào)水道，不能輸布津液而導(dǎo)致的便秘，其病理機(jī)制與 VIP、SP亦有密切聯(lián)系。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)從胃腸動(dòng)力角度出發(fā)，通過(guò)觀察大鼠肺病狀態(tài)下胃腸功能和肺、結(jié)腸組織VIP、SP表達(dá)變化，證實(shí)肺病可傳變至“腸”;并根據(jù)肺的宣發(fā)肅降和通調(diào)水道功能對(duì)大腸傳導(dǎo)及主津、小腸主液功能的影響，闡釋大鼠肺病狀態(tài)下出現(xiàn)肺、結(jié)腸組織VIP、SP表達(dá)變化的病理機(jī)制，提示VIP、SP很可能是肺與大腸相聯(lián)系的共同物質(zhì)基礎(chǔ)，肺與大腸在病理情況相互的影響可能是通過(guò)VIP、SP等神經(jīng)肽物質(zhì)的相關(guān)調(diào)控實(shí)現(xiàn)的，為“肺病及腸”病理傳變機(jī)制提供一定的研究思路，值得更深層次的研究。

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