魏亞松，劉 坤，溫建新*，鄒 玲

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東 青島 266032)

近年來(lái)，水貂等小型毛皮動(dòng)物消化道菌群的研究已成為一個(gè)重要的新課題。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)動(dòng)物消化道菌群的研究報(bào)道較少，尤其是對(duì)水貂腸道菌群的研究未見報(bào)道。其中，乳酸菌作為動(dòng)物腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群之一，其對(duì)動(dòng)物的有益作用已被許多研究結(jié)果所證實(shí)[1]。乳酸桿菌是仔豬腸道正常微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，可利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生大量乳酸、乙酸及其他揮發(fā)性脂肪酸，對(duì)維持仔豬腸道微生物區(qū)系平衡和消化機(jī)能起著重要作用[2-3]。市售乳酸桿菌菌株大部分是從人和哺乳動(dòng)物腸道中或土壤中分離得到的。寄主的遺傳特性和環(huán)境影響腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，寄主和腸道菌之間存在著相互選擇、相互依賴的關(guān)系，因而一種適于某類動(dòng)物的微生態(tài)制劑不一定適于另一類動(dòng)物。要保持定植能力，活菌制劑的生產(chǎn)菌種應(yīng)從同種屬宿主分離。鑒于此,本研究擬從健康水貂腸道中分離篩選出耐酸、抑菌效果好、安全等特點(diǎn)的菌株，為開發(fā)應(yīng)用于防治水貂腹瀉性疾病的微生態(tài)制劑提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)材料 健康成年丹麥紅眼母貂1只，來(lái)自青島某水貂養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)公司，莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基購(gòu)于青島高科園海博生物技術(shù)有限公司、糖醇發(fā)酵管(葡、麥、蔗、乳、甘、木、果、山、七葉苷等)、藥敏紙片購(gòu)杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 DNA提取和16S rRNA基因擴(kuò)增所用試劑 PBS緩沖液，TE緩沖液，細(xì)菌裂解液，Premixed Taq(incl dye)、DL 2 000 DNA Marker購(gòu)自北京托普賽生物有限公司，電泳級(jí)瓊脂糖Agarose Regular購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的采集與處理 分別取各段腸粘膜和糞便樣品1 g，分別置于含生理鹽水9 mL三角瓶，振蕩混勻30 min，制成勻漿后，靜置15 min，制成10-1的稀釋液。

1.2.2 分離純化 取樣品的稀釋液100 μL涂布于含有碳酸鈣的MRS培養(yǎng)基上，厭氧37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取有溶鈣圈的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢。疑似陽(yáng)性的菌落接種到莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)。

1.2.3 生化試驗(yàn)鑒定 按常規(guī)方法[4-5]對(duì)分離的菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)、KOH試驗(yàn)，吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、糖醇發(fā)酵試驗(yàn)、MR試驗(yàn)、VP試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、西蒙氏枸櫞酸鹽試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)及運(yùn)動(dòng)力試驗(yàn)等。

1.2.4 16S rRNA基因片段的序列分析 將分離的菌株接種于5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)，取4.5 mL菌液12 000 r/min離心2 min，參考文獻(xiàn)[6]的方法提取DNA。

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-8]，由上海生工生物工程有限公司合成了一對(duì)為乳酸桿菌屬特異性引物(Lac16S正向371 5'-GCAGTAGGGAATCTTCCACA-3'，Lac16S反向593 5'-GCTTTA CGCCCAATAAATC-3'，擴(kuò)增片斷長(zhǎng)度為223 bp)。

PCR反應(yīng)體系：Premixed Taq 25 μL，正反向引物各加1 μL，DNA模板2 μL，補(bǔ)ddH2O 至體積為50 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min預(yù)變性；94 ℃ 30 s變性，56 ℃ 30 s退火，72 ℃ 30 s延伸，循環(huán)35 次；72 ℃ 5 min延伸。取5 μL PCR產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)電泳后在凝膠成像儀中觀察擴(kuò)增結(jié)果。

PCR產(chǎn)物經(jīng)試劑盒純化后，送北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。采用BLAST與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中已收錄的乳酸桿菌屬16S rRNA的序列比對(duì)，并使用MegAlian中的Clustal X Method進(jìn)行同源性比較[9]。

1.2.5 耐酸試驗(yàn) 調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)肉湯pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，分別裝入試管中，每管5 mL。將菌株液體培養(yǎng)物10 μL接入，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，觀察菌株生長(zhǎng)情況[10-11]。

1.2.6 生長(zhǎng)曲線及產(chǎn)酸試驗(yàn) 將篩選出的乳酸菌接種于盛有MRS液體培養(yǎng)基(接種量為1∶50)的三角瓶中，37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)48 h。其中每隔2 h 取樣于紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液的OD值(600 nm) 和pH，并繪制曲線[12-14]。用未接種的培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

1.2.7 藥敏試驗(yàn) 采用紙片擴(kuò)散試驗(yàn)法。將乳酸菌懸液稀釋至108 cfu/mL后取100 uL涂布于MRS培養(yǎng)基上，用滅菌的鑷子將藥敏片貼到培養(yǎng)基表面，輕輕壓實(shí)。將培養(yǎng)基置于37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定藥敏圈直徑[15]。

1.2.8 抑菌試驗(yàn) 將致病性大腸桿菌和沙門氏菌分別接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃，180 r/min過(guò)夜培養(yǎng)后，稀釋菌液濃度至0.5個(gè)麥?zhǔn)媳葷釂挝?，將已滅菌的普通培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒在培養(yǎng)皿內(nèi)(每皿15 mL)，待其凝固。此外，將融化的普通培養(yǎng)基冷卻到50 ℃左右加入致病菌株，將混有菌的培養(yǎng)基5 mL加到已凝固的培養(yǎng)基上待其凝固。然后以無(wú)菌操作在培養(yǎng)基表面垂直放上牛津杯，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)空隙，在杯中加入乳酸菌發(fā)酵液[16-17]。置于37 ℃培養(yǎng)16～18 h，然后用測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算其平均值。

1.2.9 安全性試驗(yàn) 選取體重18～22 g的昆明系小白鼠10只，隨機(jī)分組，每組5只。按3.6×108CFU/mL的劑量對(duì)空腹8 h后的試驗(yàn)小鼠每天每次經(jīng)口灌胃0.3 mL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。每天觀察和記錄，14 d結(jié)束試驗(yàn)后，剖檢觀察內(nèi)臟及其它組織器官有無(wú)變化[18]。

2 結(jié) 果

2.1 菌落形態(tài)及鏡檢結(jié)果

菌落形態(tài)為中央凸起、邊緣整齊、黃色或白色半透明狀菌落。鏡檢為革蘭氏陽(yáng)性菌，菌體形態(tài)為桿狀，多數(shù)呈鏈條狀排列(如圖1)，命名為RSJ。

2.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果

分離菌的觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)等皆為陰性(見表1)，根據(jù)RSJ菌的菌落、鏡檢形態(tài)和生化試驗(yàn)，參照文獻(xiàn)[19-20]初步鑒定為乳酸桿菌屬(Lactobacillus)。

圖1 RSJ的菌落形態(tài)與革蘭染色鏡檢(×1000)Fig.1 The colonial morphology, Gram staining of RSJ

2.3 PCR鑒定結(jié)果

用乳酸桿菌屬特異性引物對(duì)菌株RSJ進(jìn)行PCR鑒定，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示在223 bp處有特異性條帶(圖2)。

將分離的RSJ菌株的測(cè)序結(jié)果與其他17個(gè)從GenBank獲取的乳酸桿菌屬的核酸序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示比對(duì)的幾個(gè)菌株的同源性在91.2%～94.7%之間(圖3)，RSJ菌株被鑒定為乳酸桿菌屬。

2.4 耐酸試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)RSJ菌株進(jìn)行不同pH生長(zhǎng)情況試驗(yàn)，判定試驗(yàn)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)是依據(jù)營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基底部是否有白色沉淀，如果有白色沉淀，搖動(dòng)呈渾濁狀，說(shuō)明菌株在此培養(yǎng)條件下能夠進(jìn)行繁殖生長(zhǎng)。結(jié)果表明，pH 2.0和3.0時(shí)，培養(yǎng)液搖勻后清澈，菌株在此pH基本不生長(zhǎng)；pH 4.0時(shí)，培養(yǎng)液微混，菌株生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)不好；pH 5.0和6.0時(shí)，培養(yǎng)液底部的有白色沉淀，搖勻后渾濁，菌株生長(zhǎng)良好(圖4)。

表1 RSJ的生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果Table 1 The biochemical test results of RSJ

2.5 生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸試驗(yàn)

由圖5看出，菌株RSJ在6 h開始進(jìn)入對(duì)數(shù)期，前18 h菌株繁殖較快，OD600值持續(xù)生長(zhǎng)，此時(shí)pH急速下降；從18～36 h，OD600值趨于平穩(wěn)在1.670，pH趨于3.98，菌株維持在穩(wěn)定期。

圖2 菌株RSJ的16S rRNA 基因PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The PCR amplified result of 16 s rRNA genes of Strain RSJ

圖3 RSJ與其他菌株核酸序列的同源性比較結(jié)果Fig.3 The nucleic acid sequence homology comparison results of RSJ with other strains

圖4 菌株RSJ的耐酸試驗(yàn)結(jié)果0.不接菌對(duì)照；2-6.不同pH培養(yǎng)基培養(yǎng)；7.接菌對(duì)照Fig.4 The acid test results of Strain RSJ0.No adding bacterial control; 2-6. Growth condtion in the different pH value broth culture;7. Adding bacterial control

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

用標(biāo)準(zhǔn)敏感菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923(S.aureusATCC25923)作為質(zhì)控菌，試驗(yàn)菌對(duì)抗生素的藥敏性參照WHO提供的NCCLS的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷。對(duì)菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)，得到菌株對(duì)16種抗生素的藥敏結(jié)果見表2。由表2知，菌株RSJ對(duì)青霉素、慶大霉素和環(huán)丙沙星等有一定的耐藥性，其中對(duì)青霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性較強(qiáng)，對(duì)其余抗生素則表現(xiàn)為敏感。

2.7 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

菌株RSJ對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌均有抑菌作用，其中對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈為8.3 mm，對(duì)大腸桿菌的抑菌圈為9.5 mm。

圖5 菌株RSJ的生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酸曲線Fig.5 The growth curve and acid yield curve of strain RSJ

2.8 安全性試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)14 d灌服觀察，小鼠生長(zhǎng)狀況良好，無(wú)死亡現(xiàn)象；剖檢內(nèi)臟組織器官無(wú)肉眼可見異常變化，說(shuō)明菌株RSJ對(duì)小鼠無(wú)毒性。

3 討 論

使用益生菌，首要問(wèn)題是要考慮其定植性，活菌在體內(nèi)定植是極為復(fù)雜的，具有宿主種屬特異性。所以，篩選菌種時(shí)，應(yīng)盡量選用來(lái)自該動(dòng)物屬宿主分離的正常菌群，這樣菌株進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)才較易存活，并能與致病菌搶奪附著點(diǎn)，具有很強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)采取健康成年母貂的新鮮腸粘膜和糞便，利用改良MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)，結(jié)合16S rRNA分子生物學(xué)鑒定，鑒定出1株乳酸桿菌RSJ，并對(duì)RSJ菌株的生長(zhǎng)情況和安全性等生物特性進(jìn)行了研究。

表2 RSJ的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The drug susceptibility test results of strains RSJ

注：R.耐藥；M.中敏；S.敏感。

Note: R.resistance; M.moderate sensitive; S. sensitive.

傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定方法試驗(yàn)周期長(zhǎng)、工作量大、試驗(yàn)結(jié)果依賴人的主觀判斷。近年來(lái)，逐步建立起來(lái)的16S rRNA序列分析方法，通過(guò)提取樣品中微生物的總DNA，直接從核酸水平對(duì)樣品進(jìn)行分析研究，為細(xì)菌的分類、鑒定提供了新的研究方法[21]。據(jù)孫曉雯等[22]報(bào)道，從豬糞便中分離得到一株新飼用乳桿菌，對(duì)其16S rDNA基因進(jìn)行了測(cè)序并進(jìn)行BLAST比對(duì)，和16S rDNA序列分析鑒定為約氏乳桿菌。陳麗園等[23]通過(guò)對(duì)菌體形態(tài)特征、菌落特征和生理生化特性的分析，最終將1 株抗雞沙門氏菌的乳酸菌歸類為乳酸乳桿菌亞軍。

從水貂體內(nèi)分離到的菌種制成微生態(tài)制劑對(duì)促進(jìn)水貂的生長(zhǎng)會(huì)有較為明顯的效果[12]。本試驗(yàn)分離的菌株來(lái)自健康的水貂腸道，理論上講，能夠很好地適應(yīng)水貂腸道。本試驗(yàn)只對(duì)乳酸桿菌進(jìn)行了屬的鑒定，還需要對(duì)其進(jìn)行種鑒定，以及對(duì)其在水貂上的安全性試驗(yàn)以及效果等方面有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

從水貂腸道分離的1株優(yōu)勢(shì)菌株(RSJ)，為乳酸桿菌屬。RSJ在10 h進(jìn)入對(duì)數(shù)期，前22 h菌株繁殖較快，pH急速下降；22～36 h，菌株維持在穩(wěn)定期；其對(duì)青霉素和環(huán)丙沙星的耐藥性較強(qiáng)；對(duì)小白鼠安全無(wú)毒，且對(duì)酸環(huán)境有一定的耐受性，其代謝產(chǎn)物對(duì)致病性大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有抑制作用，具備了益生菌的基本條件。

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