高書鋒，張德元，陳海榮，孫翔宇，周映華，胡新旭，周小玲，劉惠知

(湖南省微生物研究所，湖南 長沙 410009)

近年來抗生素作為飼料添加劑導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品質(zhì)量及環(huán)境藥物殘留等問題十分突出[1-2]。微生態(tài)制劑已成為一種新型抗生素替代品[3]，國家政策大力支持其在畜禽養(yǎng)殖領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)是近年來益生菌領(lǐng)域研究熱點，除具乳酸菌和雙歧桿菌等保健功效外[4]，還具抗逆性強、耐高溫和易貯存等芽孢桿菌所具有的獨特性[5]，在國外已廣泛應(yīng)用于保健、醫(yī)療、食品和畜牧等領(lǐng)域[6]。凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽添加劑方面的應(yīng)用報道日益增多，但有關(guān)其產(chǎn)業(yè)化方面的報道相對較少。本文通過Plackett-Burman試驗對影響因子進行考察和評價，然后對關(guān)鍵影響因素進行最陡爬路徑試驗，進一步采用響應(yīng)面法研究和探討及其交互作用，獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成，為其產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌 種

凝結(jié)芽孢桿菌菌種由本實驗室分離保存。

1.2 主要設(shè)備

DGX-9143B-1電熱恒溫干燥箱、BH-2型OLYMPUS顯微鏡、PHS-3C型數(shù)顯酸度計、WJ-250B生化培養(yǎng)箱、ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器等。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，瓊脂18 g/L，pH=7.0-7.2。

1.3.2 種子培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L， pH=7.0-7.2。

1.3.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 葡萄糖10 g/L、蛋白胨10 g/L、一水硫酸錳 0.169 g/L、硝酸鈉 0.34 g/L和七水硫酸鎂 0.74 g/L，pH=7.0-7.2。

1.4 培養(yǎng)方法

將凝結(jié)芽孢桿菌保藏菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，備用。取3環(huán)活化菌種，接入裝有75 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，37 ℃、200 r/min培養(yǎng)20 h。

1.5 菌體數(shù)及芽孢數(shù)檢測

發(fā)酵液取樣，用無菌水進行梯度稀釋，傾注法檢測含菌量，重復(fù)3次，檢測菌體數(shù)。取10 mL發(fā)酵液，置90 mL無菌水中，80 ℃水浴熱處理15 min，用無菌水進行梯度稀釋，傾注法檢測芽孢的形成量，重復(fù)3次，檢測芽孢數(shù)。芽孢率為芽孢數(shù)與菌體數(shù)的比值。檢測培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，胰蛋白胨20 g，酵母膏10 g，瓊脂18 g，鹽溶液10 mL(1 mL鹽溶液含：七水硫酸鎂5 mg，一水硫酸錳1 mg，碳酸鈣2 mg，氯化鈉5 mg)。

1.6 不同培養(yǎng)基對凝結(jié)孢桿菌發(fā)酵水平的影響

1.6.1 碳源對發(fā)酵水平的影響 以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖的碳含量計算碳濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源分別用蔗糖、淀粉、葡萄糖、麥麩和糖蜜替換，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.2 氮源對芽孢發(fā)酵水平的影響 以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中蛋白胨含量計算氮濃度，將基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中氮源分別用蛋白胨、酵母膏、大豆粉、魚粉、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比為1:1)、硝酸鉀和硫酸銨替換，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.3 碳氮比對發(fā)酵水平的影響 將優(yōu)化得到的最佳碳源和復(fù)合氮源分別按4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3和1∶4的替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳氮源，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.4 復(fù)合氮源(大豆粉和魚粉)對發(fā)酵水平的影響 經(jīng)上述優(yōu)化，得到最佳氮源為大豆粉和魚粉、質(zhì)量比為1∶1，改變大豆粉和魚粉質(zhì)量比例，研究不同質(zhì)量比例的大豆粉和魚粉對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響，選取5種不同質(zhì)量比例的大豆粉和魚粉進行發(fā)酵試驗， 5種不同質(zhì)量比例(大豆粉：魚粉)分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶3。接種量為5%，裝液量為15%，置35℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.6.5 無機鹽對芽孢形成率的影響 去掉基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的無機鹽，分別添加0.002 mol/L硫酸錳、硫酸鎂、氯化鈉、三氯化鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉、碳酸鈣和硝酸鈉，以不加任何無機鹽的發(fā)酵培養(yǎng)基作對照，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.7 影響凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的重要因素篩選

根據(jù)碳氮源單因素篩選試驗及無機鹽單因素試驗結(jié)果，采用Plackett-Burman(P-B)兩水平法，選用試驗次數(shù)N=12試驗設(shè)計，對碳源、氮源和無機鹽6種因素進行考察，每個因素各取兩個水平，對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液菌體數(shù)進行響應(yīng)，篩選影響凝結(jié)芽孢桿菌活菌體數(shù)的重要因素，以期確定最佳配方，設(shè)計因素及水平見表1。根據(jù)P-B試驗設(shè)計方案配制培養(yǎng)基，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

表1 P-B試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Levels and factors of the Plackett-Burman design

1.8 最陡爬坡路徑逼近響應(yīng)區(qū)試驗

根據(jù)P-B試驗結(jié)果，用Minitab軟件對P-B試驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合分析，確定主要影響因子，在其它因素保持原始水平不變下，對淀粉、大豆粉+魚粉和磷酸氫二鉀進行最陡爬坡試驗，根據(jù)所得一次回歸方程安排最陡爬坡試驗，一次回歸方程系數(shù)正負和大小確定爬坡方向和步長，系數(shù)為負，則該因素水平為遞減，反之遞增，系數(shù)越大變化越小，盡而快速的接近最大響應(yīng)區(qū)域[7]。最陡爬坡試驗設(shè)計見表8，分別按表8配制培養(yǎng)基，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

1.9 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值

根據(jù)最陡爬坡試驗得到的中心點，對淀粉、魚粉和磷酸氫二鉀進行中心試驗組合設(shè)計，運用Minitab軟件采用Box-Behnken法，創(chuàng)建響應(yīng)面設(shè)計，進行響應(yīng)面分析，中心點3次重復(fù)。響應(yīng)面分析因素及水平見表2，根據(jù)響應(yīng)面試驗設(shè)計方案配制培養(yǎng)基，接種量為5%，裝液量為15%，置35 ℃、200 r/min搖床發(fā)酵，發(fā)酵42 h，分別檢測發(fā)酵液菌體數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分對凝結(jié)孢桿菌發(fā)酵水平的影響

2.1.1 不同碳源對發(fā)酵水平的影響 不同碳源對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響結(jié)果見表3。由表3知，碳源為葡萄糖時菌體數(shù)最高，為25.8×108CFU/mL，碳源為淀粉時菌體數(shù)次之，為23.2×108CFU/mL，考慮到碳源為淀粉時，菌體數(shù)和葡萄糖差異不大，且芽孢率和芽孢數(shù)均最高，分別為55.17%和12.8×108CFU/mL，因此選擇淀粉為發(fā)酵最佳碳源。

2.1.2 不同氮源對發(fā)酵水平的影響 由表4可知，大豆粉+魚粉、魚粉和大豆粉為氮源時，凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)和芽孢率均較高，菌體數(shù)分別為39.5×108CFU/mL、37.8×108CFU/mL和33.4×108CFU/mL；芽孢率分別為63.29%、62.43%和64.97%；硝酸鉀和硫酸銨為氮源時，菌體數(shù)和芽孢率都比較低，可見有機氮源和無機氮源對凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)和芽孢率的影響差異很大，因此選用有機復(fù)合氮源大豆粉+魚粉(1:1)為凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵最佳氮源。

表2 響應(yīng)面分析因素水平表Table 2 Levels and factors of the response surface analysis

表3 不同碳源對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 3 The influence of different carbon sources on fermentation level of Bacillus coagulans

2.1.3 不同碳氮比對發(fā)酵水平的影響 由表5可知，碳氮比為1∶2、1∶1和1∶3時，凝結(jié)芽孢桿菌菌體數(shù)較高，分別為40.6×108CFU/mL、38.3×108CFU/mL和37.2×108CFU/mL，且各不同碳氮比處理芽孢率基本相同，因此，選擇1∶2為凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵最佳碳氮比。

表4 不同氮源對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 4 The influence of different nitrogen sources on fermentation level of Bacillus coagulans

表5 不同碳氮比對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 5 The influence of different carbon nitrogen ratio on fermentation level of Bacillus coagulans

2.1.4 不同比例復(fù)合氮源對發(fā)酵水平的影響 由表6知，復(fù)合氮源大豆粉和魚粉質(zhì)量比為2∶1和1∶1時，菌體數(shù)和芽孢數(shù)較高，菌體數(shù)分別為37.5×108CFU/mL和35.4×108CFU/mL，芽孢數(shù)分別為24.0×108CFU/mL和22.7×108CFU/mL，由各處理芽孢率差異不大，故選擇2∶1為凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵復(fù)合氮源大豆粉和魚粉的最佳質(zhì)量比。

2.1.5 無機鹽對發(fā)酵水平的影響 由表7可知，添加磷酸氫二鉀、硫酸鎂、磷酸二氫鈉和硝酸鈉時，菌體數(shù)分別為21.5×108、15.6×108、15.2×108、14.1×108CFU/mL，均高于對照菌體數(shù)10.6×108CFU/mL；從芽孢數(shù)看，添加磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、碳酸鈣、硫酸鎂和硫酸錳時，與對照相比，芽孢數(shù)均有不同程度提高。

表6 不同比例復(fù)合氮源對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的影響Table 6 The influence of composite carbon sources of different proportions on fermentation level of Bacillus coagulans

表7 不同無機鹽對凝結(jié)芽孢桿菌芽孢形成率的影響結(jié)果Table 7 The influence of different inorganic salts on fermentation level of Bacillus coagulans

2.2 影響凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的重要因素篩選

P-B試驗設(shè)計及結(jié)果見表8。運行Minitab軟件對試驗結(jié)果進行各因素效應(yīng)計算及重要性評價，結(jié)果見表9。淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀三個因素效應(yīng)值的絕對值較大，絕對值越大，該因素對菌體數(shù)影響越大。從P值看，淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀三個因素置信度均高于95%，其P值分別為0.025、0.037和0.047，其它因素在α=0.05水平上對菌體數(shù)影響不顯著，因此，將淀粉、魚粉+大豆粉和磷酸氫二鉀三因素作為重要因素，進一步采用響應(yīng)面進行發(fā)酵條件優(yōu)化。

表8 Plackett-Burman 試驗設(shè)計及結(jié)果Table 8 The design matrix and experimental results of Plackett-Burman design and test

注：“-1，0和1”分別表示培養(yǎng)基顯著因素“低、中和高”濃度水平。下同。

Note:“-1,0 and 1”indicates respectively“l(fā)ow,medium and high”concentration level of each significant factor of culture medium.The same below.

表9 Plackett-Burman試驗因素水平的選擇及重要性評價Table 9 The selection of factor and level and importance evaluation of Plackett-Burman test

注：同列肩標“*”表示顯著(P<0.05)，“**”表示極顯著(P<0.01)。

Note:Values with superscript“*”in the same column indicate significant difference(P<0.05)，those with“**”indicate extreme difference(P<0.01).

2.3 最陡爬坡路徑逼近響應(yīng)區(qū)試驗

將P-B試驗選取的三個重要因素淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀進行最陡爬坡試驗。用Minitab軟件對P-B試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，得到一次回歸方程：菌體數(shù)=24.9+5.67A-4.70B+2.33C-5.03D+1.83E+3.07F，根據(jù)P-B試驗得出的上述一次擬合方程安排最陡爬坡試驗。一次擬合方程中各變量的系數(shù)決定爬坡方向和變化步長，如果系數(shù)為負，則該因素水平應(yīng)為遞減，反之遞增，系數(shù)越大變化越小。

顯著因素的變化方向、步長和試驗結(jié)果見表10。從表10可知，第4組試驗淀粉11.0 g/L、大豆粉+魚粉20.0 g/L和磷酸氫二鉀2.6.0 g/L時凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵菌體數(shù)最高，為54×108CFU/mL。故采用淀粉11.0 g/L、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)20.0 g/L和磷酸氫二鉀 2.6 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗的中心點。

表10 最陡爬坡試驗設(shè)計及結(jié)果Table 10 The design and results of steepest climbing test

2.4 響應(yīng)面分析法確定最大響應(yīng)值

響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表11，對響應(yīng)面試驗結(jié)果運用Minitab分析軟件對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計回歸分析，結(jié)果見表12。經(jīng)擬合得到二次回歸數(shù)學模型，R=57.4667+2.300A+1.675B+1.8C-5.74583A2-3.94583B2-2.54583C2+1.175AB-1.675AC-0.875BC回歸模型失擬項P=0.251，失擬不顯著。模型相關(guān)系數(shù)R =0.981，調(diào)整后R =09468，說明模型擬合較好。從響應(yīng)面分析三維圖可以看出淀粉、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀3個因素對菌體數(shù)的影響，如圖1～3。

表11 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 11 The design and results of response surface test

對回歸方程各自變量(A、B、C)分別求一階偏導(dǎo)數(shù)，并均令其為0，即可得到三元一次線性方程組，求解即得極值點：A=0.2057，B=0.2309，C=0.3038，對應(yīng)淀粉為10.6 g/L、大豆粉為13.5 g/L、魚粉為6.7 g/L、磷酸氫二鉀為2.72 g/L，預(yù)測響應(yīng)最大值為63.2357。

試驗結(jié)果表明，最佳培養(yǎng)基組成為淀粉 10.6 g/L、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)20.2 g/L、磷酸氫二鉀 2.72 g/L、其它無機鹽(磷酸二氫鈉0.312 g/L、碳酸鈣0.2 g/L、一水硫酸錳 0.234 g/L、硝酸鈉 0.34 g/L和七水硫酸鎂 0.74 g/L)。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件下進行發(fā)酵，發(fā)酵液活菌數(shù)可達67×108CFU/mL。

表12 回歸模型及方差分析結(jié)果Table 12 The result of regression model and analysis of variance

3 討 論

凝結(jié)芽孢桿菌在畜禽添加劑方面的應(yīng)用報道日益增多，但有關(guān)其產(chǎn)業(yè)化方面的報道相對較少，分析其原因，主要是凝結(jié)芽孢桿菌在產(chǎn)業(yè)化過程中存在兩個關(guān)鍵限制因素，低菌體量和低芽孢率，解決辦法主要集中在菌體量發(fā)酵優(yōu)化[8-13]，而結(jié)合提升芽孢率的菌體量發(fā)酵優(yōu)化亟待解決。鑒于此，本研究通過單因素試驗，兼顧菌體數(shù)和芽孢率，對碳氮源、碳氮比和無機鹽進行篩選，一方面為解決產(chǎn)業(yè)化過程的瓶頸，另一方面為進一步的響應(yīng)面試驗奠定基礎(chǔ)。

在P-B試驗結(jié)果分析表明，淀粉、魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)和磷酸氫二鉀三因素效應(yīng)值分別為11.333、-9.400和-10.067，置信度均高于95%，P值分別為0.025、0.037和0.047，是顯著影響凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平的重要因素。淀粉成為顯著影響發(fā)酵因素，分析其原因可能與碳源淀粉酶降解轉(zhuǎn)化成葡萄糖，為細菌生命活動提供能量和合成細胞骨架物質(zhì)等有關(guān)，這與該凝結(jié)芽孢桿菌菌株產(chǎn)淀粉酶活力強一致。魚粉和大豆粉成為顯著性因素，主要原因可能是氮源被分解為各種氨基酸，能夠重新用來合成細胞蛋白質(zhì)和核酸等重要生命物質(zhì)。劉馨磊等[11]和陳秋紅等[12]對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵優(yōu)化的研究表明，磷酸氫二鉀在發(fā)酵培養(yǎng)中有重要作用。而本研究中，無機鹽磷酸氫二鉀成為顯著影響發(fā)酵因素，可能是其間接參與了細胞相關(guān)代謝。

單從P-B試驗淀粉因素看，高水平各處理平均菌體數(shù)為30.53×108CFU/mL，而低水平各處理平均菌體數(shù)為19.20×108CFU/mL，因此，應(yīng)選擇高水平濃度12.5 g/L；單從P-B試驗魚粉+大豆粉(質(zhì)量比=2∶1)因素看，高水平各處理平均菌體數(shù)為20.17×108CFU/mL，而低水平各處理平均菌體數(shù)為29.57×108CFU/mL，因此，應(yīng)選擇低水平濃度15.0 g/L；單從P-B試驗磷酸氫二鉀因素看，高水平各處理平均菌體數(shù)為19.83×108CFU/mL，而低水平各處理平均菌體數(shù)為29.90×108CFU/mL，因此，應(yīng)選擇低水平濃度1.7 g/L。最陡爬坡試驗結(jié)果中心點為淀粉11.0 g/L、大豆粉+魚粉(質(zhì)量比=2∶1)20.0 g/L和磷酸氫二鉀2.6 g/L。各因素水平并不完全一致，說明各因素間有一定的交互影響作用，而最陡爬坡試驗則消除了該種交互影響作用，并為進一步響應(yīng)面試驗優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

響應(yīng)面試驗結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計回歸分析擬合，得到二次回歸數(shù)學模型，經(jīng)求解得到極值點，對應(yīng)最佳培養(yǎng)基組成：淀粉為10.6 g/L、大豆粉為13.5 g/L、魚粉為6.7 g/L、磷酸氫二鉀為2.72 g/L，液體發(fā)酵活菌數(shù)達67×108CFU/mL，發(fā)酵水平較優(yōu)化前提高50×108CFU/mL。目前，國內(nèi)多家單位采用正交試驗對凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵優(yōu)化進行研究，秦艷等[6]報道凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平為7.0×108CFU/mL；劉馨磊[11]等通過流加補料，菌體數(shù)達4.5×109CFU/mL，芽孢數(shù)達1.2×109CFU/mL；陳秋紅等[12]報道凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵水平達6.0×109CFU/mL；崔東良等[13]通過對凝結(jié)芽孢桿菌工業(yè)化發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化研究，菌體數(shù)達9.3×109CFU/mL。然而通過正交試驗獲得的優(yōu)選值不會超越所取水平范圍，也不能給進一步試驗提供明確指向性，而通過P-B試驗可快速篩選出重要響應(yīng)因素，為最陡爬坡試驗指明方向及變化步長，并逼近最大響應(yīng)區(qū)域，通過中心組合試驗和響應(yīng)面分析得到擬合模型方程，進而獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組分濃度，因此，響應(yīng)面法優(yōu)化更加具有科學性和準確性。

4 結(jié) 論

通過響應(yīng)面法獲得凝結(jié)芽孢桿菌最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為：淀粉 10.6 g/L、大豆粉 13.5 g/L、魚粉 6.7 g/L、磷酸氫二鉀 2.72 g/L、磷酸二氫鈉0.312 g/L、碳酸鈣0.2 g/L、一水硫酸錳 0.234 g/L、硝酸鈉 0.34 g/L和七水硫酸鎂 0.74 g/L。在此最佳發(fā)酵培養(yǎng)基下進行發(fā)酵，發(fā)酵液菌體數(shù)達67×108CFU/mL。參考以上國內(nèi)研究的發(fā)酵水平數(shù)據(jù)，該試驗菌株的發(fā)酵水平還有一定提升空間，另一方面也為其進一步發(fā)酵罐放大和中試轉(zhuǎn)化提供了理論依據(jù)。

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