于春艷，劉 希，于春榮，張 鈺，蘇 靜，劉玉和

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2. 北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院實驗中心，吉林 吉林 132013；3.北京昭衍新藥研究中心有限公司毒理部，北京 100176；4.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理 生理學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

人宮頸癌HeLa細(xì)胞氧化損傷中溶酶體與線粒體損傷的時間順序及其意義

于春艷1，劉 希2，于春榮3，張 鈺4，蘇 靜4，劉玉和1

(1.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林132013；2. 北華大學(xué)化學(xué)與生物學(xué)院實驗中心，吉林 吉林 132013；3.北京昭衍新藥研究中心有限公司毒理部，北京 100176；4.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院病理 生理學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

目的: 探討溶酶體及線粒體死亡途徑在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡過程中的時間順序及其意義，闡明溶酶體膜通透性在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體凋亡過程中的重要作用。方法：以對數(shù)生長期人宮頸癌HeLa細(xì)胞作為研究對象，利用維生素K3(VK3)復(fù)制氧化應(yīng)激模型，實驗分為對照組、VK3 1 h、VK3 3 h、VK3 6 h和VK3 12 h作用組。MTT 法檢測各組細(xì)胞生存率；2′，7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)染色檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平，吖啶橙(AO)染色觀察溶酶體膜通透性，羅丹明123染色檢測線粒體膜電勢(ΔΨm)，Western blotting法檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活化片段的表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，VK3 6和12 h組HeLa細(xì)胞生存率降低(Plt;0.05)。Western blotting法檢測，與對照組比較，VK3 6和12 h組HeLa細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化片段表達(dá)水平增加(Plt;0.05)。DCFH-DA染色，VK3作用1、3及6 h，HeLa細(xì)胞內(nèi)綠色熒光增強。AO染色，VK3 3 h 和6 h組可見HeLa細(xì)胞的溶酶體內(nèi)紅色顆粒狀熒光減弱，細(xì)胞漿綠色熒光增強。羅丹明123染色，VK3 6 h組可見HeLa細(xì)胞漿內(nèi)紅色熒光強度明顯降低(提示ΔΨm下降)。結(jié)論：氧化損傷能夠誘導(dǎo)溶酶體及線粒體死亡途徑，并且溶酶體的變化先于線粒體，提示溶酶體通透性在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體凋亡過程中具有重要作用。

氧化應(yīng)激；溶酶體；線粒體；細(xì)胞凋亡

研究[1-3]發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞內(nèi)活性氧簇( reactive oxygen species,ROS)除了能引起線粒體膜通透性增加而參與細(xì)胞凋亡以外，還能直接損傷溶酶體膜。溶酶體膜通透性增加，就會導(dǎo)致溶酶體酶釋放入細(xì)胞漿。另有研究[4]發(fā)現(xiàn)：溶酶體酶釋放作用于線粒體，促進(jìn)線粒體產(chǎn)生ROS，因此導(dǎo)致溶酶體膜通透性進(jìn)一步增加。本文作者前期研究[5]發(fā)現(xiàn)：維生素K3 (Vitamin K3,VK3)能引起ROS增多，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而且線粒體融合分裂基因表達(dá)的改變與腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。然而，溶酶體及線粒體調(diào)節(jié)VK3引起腫瘤細(xì)胞凋亡過程的具體作用尚未明確。因此本實驗以HeLa細(xì)胞作為研究對象，采用VK3復(fù)制氧化應(yīng)激模型，觀察VK3作用不同時間后，HeLa細(xì)胞溶酶體膜和線粒體膜變化的時間順序以及凋亡相關(guān)蛋白caspase-3活化片段的蛋白表達(dá)情況，探討溶酶體及線粒體在細(xì)胞凋亡過程中的時間順序及其相互作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人HeLa 細(xì)胞購自中國科學(xué)院和北京協(xié)和醫(yī)院。新生小牛血清購于Gibco公司，IMDM 培養(yǎng)基購自Hyclone公司；細(xì)胞裂解液RIPA購自碧云天生物技術(shù)研究所；MTT粉末、吖啶橙(AO)和羅丹明123均購自美國Sigma公司；caspase-3活化片段(cleaved caspase-3)和β-actin 抗體均購自Santa Cruz 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。自動CO2恒溫培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)，蛋白質(zhì)電泳裝置及轉(zhuǎn)移系統(tǒng)(Bio-rad公司，美國)，凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司GIS凝膠成像系統(tǒng))，激光共聚焦顯微鏡(OLYMPUS FV1000，日本)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa細(xì)胞置于完全培養(yǎng)基(10% 新生牛血清，IMDM 培養(yǎng)液，pH7.4) 中，37℃、5 %CO2培養(yǎng)。實驗分組：對照組(細(xì)胞用IMDM 培養(yǎng))和VK3(終濃度為30 μmol·L-1)1 h、3 h、6 h、12 h組。

1.3 MTT 法檢測細(xì)胞生存率 各組細(xì)胞以1×104/孔種至96孔板，每孔100 μL，每組細(xì)胞6復(fù)孔，于培養(yǎng)結(jié)束前4 h，加入5 g·L-1MTT 20 μL。培養(yǎng)結(jié)束后，傾去培養(yǎng)基，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩混勻，使結(jié)晶完全溶解，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定其吸光度(A) 值。A值可間接反映活細(xì)胞數(shù)量，用以檢測細(xì)胞活性。對照組細(xì)胞生存率為100%，其余各組細(xì)胞生存率=(各濃度組A值/對照組A值)×100%。

1.4 Western blotting法檢測cleaved caspase-3蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以β-actin水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對照，取50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；5%奶粉室溫封閉2 h后，用含0.01% Tween 20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min；加入相應(yīng)的抗體cleaved caspase-3和β-actin (1∶200)，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次后加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000)，37℃搖床溫育2 h；TBST漂洗3次，每次10 min；DAB顯色，凝膠圖像分析系統(tǒng)分析蛋白的表達(dá)。

1.5 DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平 將各組細(xì)胞的培養(yǎng)液棄掉，PBS洗2次，加入含DCFH-DA(10 μmol·L-1)的PBS 1 mL，37℃孵育20 min，PBS洗滌細(xì)胞3次(5 min·次-1)，以充分去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。激發(fā)波長488 nm，發(fā)射波長525 nm，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強度，判斷細(xì)胞內(nèi)的活性氧情況[6]。

1.6 AO染色[7]檢測溶酶體穩(wěn)定性 將AO加入各組細(xì)胞中，終濃度為1 μmol·L-1，37℃孵育15 min，棄去染料，用PBS 洗滌3次，405 nm激發(fā)光下激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光和紅色熒光強度。

1.7 羅丹明123染色檢測線粒體膜電勢(ΔΨm) 將羅丹明加入各組細(xì)胞中，終濃度為10 μmol·L-1，避光，37℃孵育30 min (每隔10 min 振搖1次)[8]。PBS 洗滌3次，激發(fā)光波長為488 nm，發(fā)射光波長為534 nm，激光共聚焦顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強度，熒光強度愈強，ΔΨm愈大。

2 結(jié) 果

2.1 VK3作用不同時間點HeLa細(xì)胞的生存率 30 μmol·L-1VK3 1、3、6和12 h組細(xì)胞生存率分別為(98.6±2.32)%、(95.7±3.13)%、(88.6±4.67)%和(71.6±3.32)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Plt;0.05)。

2.2 Western blotting檢測各組HeLa細(xì)胞cleaved caspase-3的表達(dá)水平 Western blotting法檢測cleaved caspase-3蛋白表達(dá)，與對照組(0.02±0.01)比較，VK3 1 h和3 h組cleaved caspase-3表達(dá)水平(0.030±0.015和0.050±0.023)無明顯變化(Plt;0.05)，VK3 6 h和12 h組cleaved caspase-3表達(dá)水平(0.500±0.025和0.600±0.015)明顯增加(Plt;0.05)。見圖1。

2.3 各組HeLa細(xì)胞的ROS水平 DCFH-DA染色檢測結(jié)果顯示：與對照組比較，VK3作用1、3、6和12 h，HeLa細(xì)胞內(nèi)綠色熒光均增強，提示VK3作用后細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加(圖2，見插頁二)。

2.4 各組HeLa細(xì)胞的溶酶體膜通透性 AO染色共聚焦顯微鏡觀察顯示：與對照組比較，VK3作用1 h后胞漿內(nèi)綠色熒光及紅色熒光強度無變化，作用3、6和12 h后HeLa細(xì)胞的細(xì)胞漿綠色熒光增強，紅色顆粒狀熒光減弱，表明溶酶體膜穩(wěn)定性出現(xiàn)下降(圖3，見插頁二)。

圖1 Western blotting 檢測VK3作用HeLa不同時間后caspase-3活化片段蛋白表達(dá)電泳圖

Fig.1 Electrophorgram of expressions of cleaved caspase-3 proteins in HeLa cells after treated with VK3 for different time detected by Western blotting method

Lane 1: Control group;Lane 2: VK3 6 h group;Lane 3: VK3 12 h group.

2.5 各組HeLa細(xì)胞ΔΨm 羅丹明123染色共聚焦顯微鏡觀察顯示：與對照組比較，HeLa細(xì)胞在VK3作用1和3 h后細(xì)胞漿內(nèi)紅色熒光強度無變化，作用6及12 h后細(xì)胞漿內(nèi)紅色熒光強度明顯降低，提示細(xì)胞ΔΨm下降(圖4，見插頁二)。

3 討 論

溶酶體作為細(xì)胞內(nèi)消化器官，參與細(xì)胞自溶、防御等生物過程。近年研究[9]發(fā)現(xiàn)：溶酶體在死亡信號作用下釋放以組織蛋白酶為主的多種水解酶，參與細(xì)胞死亡，這一過程被稱為溶酶體途徑的凋亡。溶酶體膜通透性增加程度是決定細(xì)胞死亡類型的重要因素。

AO是一種能反映溶酶體功能狀態(tài)的探針染料[10]。AO具有親嗜溶酶體的特性，未帶電荷時可以透過細(xì)胞膜，進(jìn)入溶酶體內(nèi)。一旦AO進(jìn)入溶酶體，由于含有較高水平的質(zhì)子而被質(zhì)子化保留在溶酶體內(nèi)，表現(xiàn)出紅色顆粒狀熒光，而細(xì)胞漿表現(xiàn)出綠色熒光。DCFH-DA染色結(jié)果顯示：VK3從作用1 h開始，細(xì)胞內(nèi)綠色熒光就增強，提示VK3作用后HeLa細(xì)胞內(nèi)ROS水平增加。AO染色實驗結(jié)果顯示：VK3作用3 h后HeLa細(xì)胞漿綠色熒光增強，紅色熒光減弱，提示VK3所誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生導(dǎo)致溶酶體膜通透性增加，VK3作用6 h更明顯。由此可見，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡可能與溶酶體膜通透性增加有關(guān)。

大量的研究[10]表明：ΔΨm的破壞是細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件之一，其發(fā)生在細(xì)胞核凋亡特征(染色質(zhì)濃縮、DNA斷裂)出現(xiàn)之前，一旦線粒體跨膜電位崩潰，則細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)。本研究中VK3作用HeLa細(xì)胞6 h后，ΔΨm開始降低，提示線粒體膜通透性增加，線粒體損傷性變化的存在。本研究結(jié)果表明：VK3作用細(xì)胞后，ΔΨm降低是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞死亡過程的一個機制，而且溶酶體死亡途徑可能發(fā)生在線粒體死亡途徑之前，從而啟動溶酶體-線粒體死亡途徑。從溶酶體膜通透性增加和線粒體膜電勢降低的發(fā)生時間來看，溶酶體的變化先于線粒體。

線粒體膜通透性增加會促使線粒體外膜促凋亡蛋白細(xì)胞色素C釋放入細(xì)胞漿，有利于caspase-3激活[11-13]。有研究[14]表明：腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)產(chǎn)生的ROS，引起溶酶體膜改變早于線粒體改變；溶酶體酶作用于線粒體，促其生成ROS，后者反作用于溶酶體導(dǎo)致更多溶酶體酶的釋放。還有研究[15-16]顯示：溶酶體組織蛋白酶B和D釋放入細(xì)胞漿可以剪切Bcl-2家族蛋白Bid、Bax或Bak，引起線粒體外膜通透性增高，細(xì)胞色素C釋放、激活caspase。本研究結(jié)果顯示：VK3作用6和12 h細(xì)胞內(nèi)caspase-3活化片段蛋白表達(dá)增加，提示線粒體凋亡途徑被激活。本研究結(jié)果顯示：VK3作用3 h時可見溶酶體膜通透性增加，VK3作用6 h可見線粒體膜通透性增加，而此時可見caspase-3被激活，進(jìn)一步證明VK3引起溶酶體膜通透性增加，使線粒體膜通透性增加，從而激活caspase-3，發(fā)生線粒體凋亡，而線粒體的損傷又進(jìn)一步加重了溶酶體的損傷；溶酶體酶膜通透性增加可引起溶酶體酶釋放，同樣也會導(dǎo)致溶酶體自身的損傷。兩者不斷地相互作用，使溶酶體-線粒體損傷不斷加劇。溶酶體膜通透性增加可能是氧化應(yīng)激誘導(dǎo)線粒體凋亡途徑的至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，但溶酶體膜通透及線粒體膜通透的傳遞信號還需進(jìn)一步研究。

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TimeorderoflysosomalandmitochondrialcelldeathinoxidativeinjuryofcervicalcancerHeLacellsanditssignificance

YU Chun-yan1,LIU Xi2,YU Chun-rong3,ZHANG Yu4,SU Jing4,LIU Yu-he1

(1. Department of Pathology,College of Basic Medicine,Beihua University,Jilin 132013,China; 2. Experiment Center，College of Chemistry and Biology,Beihua University,Jilin 132013,China; 3.Department of Toxicology,JOINN Laboratories,Beijing 100176,China;4. Department of Pathophysiology, Norman Bethune College of Medicine,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the time order of lysosomal and mitochondrial cell death in human HeLa cells after oxidative stress injury and its significance,and to clarify the role of lysosomal membrane permeabilization in the process of mitochondrial apoptosis induced by oxidative stress.MethodsThe HeLa cells line was used for the study.Oxidative stress model of cervical cancer HeLa cells was established by vitamin K3 (VK3).The cells were divided into control,V3 1 h,VK3 3 h,VK3 6 h and VK 12 h groups.The vitalities of HeLa cells in various groups were measured by MTT assay.The levels of reactive oxygen species(ROS) were determined by DCFH-DA.The lysosomal membrane permeabilization was observed by AO staining,and the mitochondrail membrane permeabilization in HeLa cells was detected by Rhodamine 123 staining.The expression of apoptosis-related protein cleaved caspase-3 was determined by Western blotting method.ResultsCompared with control group,the survival rates of HeLa cells in VK3 6 h and VK3 12 h groups were decreased (Plt;0.05).Compared with control group,the cleaved caspase-3 expression levels in VK 36 h and VK3 12 h groups were increased detected by Western blotting method(Plt;0.05).The DCFH-DA results showed that after VK3 treatment for 1 h,3 h, and 6 h,the levels of green fluoresence were increased in HeLa cells.The AO staining results showed that VK3 treatment for 3 and 6 h caused a decline in the red staining of lysosomes and increase in green staining of cytoplasm.The Rhodamine 123 results revealed that VK3 treatment for 6 h induced a drop in Rhodamine 123 red staining of cytoplasm.ConclusionOxidative stress damage can induce lysosomal and mitochondrial cell death in HeLa cells,and lysosomal cell death eventuates ahead of mitochondrial,which prompting the lysosomal membrane permeabilization plays an important role in mitochondrial apoptosis pathway induced by oxidative stresss..

oxidative stress;lysosome;mitochondria;apoptosis

1671-587Ⅹ(2013)05-0872-04

10.7694/jldxyxb20130503

2013-03-14

國家自然科學(xué)基金資助課題(81202552，81272876)；吉林省教育廳科研基金資助課題(吉教科合字2011第117號，吉教科合字2012第394號)；吉林省科技廳自然科學(xué)基金資助課題(201215103)

于春艷(1975-)，女，吉林省吉林市人，副教授，醫(yī)學(xué)博士，主要從事腫瘤病理學(xué)方面的研究。

劉玉和(Tel:0432-64608556，E-mail: bhlyh1959@163.com)

R363.2

A