鄒榕凱,李 俊,時建立,柳 曉,,叢曉燕,孫文博,杜以軍,吳家強,王金寶,*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山東 青島 266109；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，山東 濟南 250100)

細胞因子(cytokine, CK)是一類能在細胞間傳遞信息，具有免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)的功能蛋白質(zhì)或小分子多肽。細胞因子作為細胞間信號分子在機體的細胞與體液免疫中發(fā)揮著重要的作用。作為機體重要的細胞因子，干擾素(Interferon，IFN)自1957年被英國學(xué)者發(fā)現(xiàn)以來，一直是細胞因子研究中比較活躍的、進展最快的一種細胞因子。干擾素的生物學(xué)功能主要表現(xiàn)在廣譜的抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能[1]，體現(xiàn)在當病毒感染機體細胞后，細胞能夠產(chǎn)生I型IFN(α-IFN，β-IFN,ω-IFN)并且很快釋放到細胞外，作用于鄰近的未受感染的細胞膜受體上，轉(zhuǎn)錄并激活I(lǐng)SGs(Interferon-stimuLated genes)，產(chǎn)生OAS(2'-5'-oligoadenylate synthetase)和Mx(Myxovirus resistance)。通過這些酶發(fā)揮抗病毒活性，從而使細胞建立抗病毒狀態(tài)[2]。

目前細胞因子表達量的檢測主要是通過相關(guān)蛋白的表達水平和mRNA的轉(zhuǎn)錄水平兩方面進行。從蛋白表達水平檢測的方法主要有ELISA、Elispot和IFA等，這些檢測技術(shù)均需要依賴特異性的抗體和一定的目的蛋白表達量，而且需要的時間較長、成本高[3]。從mRNA轉(zhuǎn)錄水平檢測細胞因子的方法主要有Northern blot、原位雜交和qPCR等[4]。其中Northern blot能對靶基因進行定量分析，但需要大量的RNA，原位雜交消耗的時間比較長，常規(guī)的qPCR方法使用方便卻難以準確定量。而qPCR方法作為一種較為簡單的方法，僅需要少量的模板在較短的時間內(nèi)即可對樣品進行定量。這種方法有較高敏感性和良好重復(fù)性，以及耗時短、操作簡單等優(yōu)點，現(xiàn)在已被許多實驗室接受，成為核酸定量檢測及基因表達分析的首選方法而得到廣泛的應(yīng)用[5,6]。

本試驗旨在建立一種用于檢測PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子的SYBR Green I qPCR方法，并利用該方法對轉(zhuǎn)接種PCV2的PK-15細胞的Mx1、OAS等α-IFN效應(yīng)因子進行相對定量分析，探討PCV2對α-IFN效應(yīng)因子的影響。同時為研究PCV2抑制α-IFN發(fā)揮效應(yīng)的信號通路特別是JAK-STAT信號通路的機理奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種、細胞和載體

PK-15細胞和PCV2由本實驗室保存，大腸桿菌DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，pMD 18-T Vector購自寶生物工程(大連)有限公司。PK-15細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM中，長滿單層備用。

1.2 主要試劑

TRIzol Reagent購自Invitrogen公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、DNAMarkerDL 2 000、凝膠回收試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNase Plus)試劑盒、PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒等購自寶生物工程(大連)有限公司；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司。

1.3 主要儀器

PTC-2000型PCR儀，美國MJResearch公司；核酸定量儀，美國Thermo公司；LightCycle?480，美國羅氏公司；冷凍離心機，德國Eppendorf公司；CO2培養(yǎng)箱，美國Thermo公司。

1.4 PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子基因的引物設(shè)計及合成

根據(jù)GenBank中豬的β-actin、Mx1、OAS基因序列，選擇保守區(qū)利用Premier 5.0軟件設(shè)計相應(yīng)的引物，經(jīng)NCBI的BLAST分析證實引物的特異性后由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，引物信息如表1所示。

1.5 RNA提取和cDNA的合成

RNA提?。喊凑誘RIzol (Invitrogen)說明書，提取細胞總RNA，并測定其濃度。

cDNA合成：根據(jù)RNA的濃度調(diào)整RNA的用量，利用PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)進行基因組DNA的去除并進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄后置于-20 ℃待用。

1.6 質(zhì)粒標準品的制備

以cDNA為模板進行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒提取DNA，然后將目的片段與pMD 18-T Vector連接，并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，涂板后于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，12 h后挑取單菌落進行單克隆培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后進行PCR鑒定，并將陽性質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

將測序正確的陽性重組質(zhì)粒用核酸定量儀測定其濃度，并計算標準品的拷貝數(shù)。調(diào)整拷貝數(shù)后進行倍比稀釋，分別以108、107、106、105、104、103、102、101、100拷貝/μL的質(zhì)粒作為標準品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

qPCR反應(yīng)按照TaKaRa的SYBR Premix Ex TaqTM (Tli RNase Plus)試劑盒進行。通過比較Ct值、熒光強度、熔解曲線以及是否有引物二聚體峰來確定最佳引物濃度、退火溫度、模板用量等，以得到最佳的qPCR反應(yīng)條件。

1.8 qPCR標準曲線的建立

以稀釋好的質(zhì)粒標準品為模板，每個樣品3次重復(fù)，經(jīng)qPCR儀檢測后得出Ct值，用儀器自動得出標準曲線和斜率，并由斜率計算擴增效率。公式為E=10-1/k-1(E為擴增效率，k為標準曲線斜率)。

1.9 qPCR靈敏性試驗

以稀釋好的拷貝數(shù)為1×100～1×107拷貝/μL質(zhì)粒標準品為模板，每個樣品3次重復(fù)，經(jīng)qPCR儀擴增后，進行敏感度分析。

1.10 qPCR重復(fù)性試驗

選取稀釋好的質(zhì)粒樣本，每個樣本3次重復(fù)，分別對其進行qPCR擴增。根據(jù)每次每個稀釋度的Ct值進行變異系數(shù)的計算，確定該方法的批間重復(fù)性。

1.11 對IFN添加濃度、作用時間的篩選

用12孔板培養(yǎng)PK-15細胞，待細胞長滿單層后，添加α-IFN進行刺激。參照Patel等[7]描述的方法，先以干擾素為1 000 U/mL的終濃度進行最佳α-IFN刺激時間篩選，根據(jù)篩選出來的最佳IFN刺激時間再進行IFN的添加濃度的篩選，以此篩選出最佳添加濃度和IFN刺激時間。

1.12 PCV2對PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子mRNA水平的影響

PK-15細胞長滿單層后，用0.25%的胰酶進行消化，將PCV2和PK-15細胞在37 ℃含5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用α-IFN處理，分別于處理24 h后提取細胞總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄，并利用LightCycle?480分別測每一個樣品各個基因的Ct值，分別計算各個基因相對表達量。

1.13 數(shù)據(jù)分析

不同組別各細胞因子含量通過2-ΔΔCT法進行比較[8]，所有數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel2003 One-way repeated measurement ANOVA進行統(tǒng)計分析。[ΔΔCt=(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)試驗組-(Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)對照組]。

2 結(jié)果與分析

2.1 PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子基因的RT-PCR擴增與陽性標準質(zhì)粒的構(gòu)建

用常規(guī)RT-PCR方法，采用設(shè)計的特異性引物，對PK-15細胞的β-actin、Mx1、OAS基因進行擴增，獲得了與各自預(yù)期片段大小一致的目的條帶。與pMD 18-T Vector連接后，將陽性質(zhì)粒測序并與參考序列進行一致性比較，結(jié)果核苷酸同源性均達到100%。純化后陽性質(zhì)粒OD260 nm/OD280 nm均介于1.8～2.0之間。

2.2 PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子基因qPCR反應(yīng)條件的優(yōu)化

目的基因的Realtime PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線 (圖1)分析表明，各目的基因擴增產(chǎn)物的溶解曲線呈單一峰，沒有出現(xiàn)引物二聚體。所以本試驗中所設(shè)計的引物特異性良好，可以用于下一步目的基因熒光定量檢測的試驗中。

優(yōu)化后的PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子β-actin、Mx1、OAS基因的qPCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR Premix Ex TaqTM(Tli RNase Plus)10 μL、上下游引物終濃度為200 nmol/L、模板1 μL、余下用Rnasefree水補至20 μL。qPCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min，95 ℃ 20 s，59℃10 s，40個循環(huán)。

2.3 熒光定量標準曲線的建立

將β-actin、Mx1、OAS陽性質(zhì)粒標準品(濃度分別為1×103～1×107copies/μL)作為qPCR反應(yīng)的模板，根據(jù)各稀釋度得到的Cp值，繪制標準曲線。如圖2所示，本研究建立的β-actin、Mx1、OAS基因的熒光定量檢測方法線性關(guān)系良好，可用于目的基因表達量的檢測。

圖2 目的基因的動力學(xué)曲線、標準曲線及線性關(guān)系Fig. 2 Kinetic curve of the standard curve and the linear relationship of the target gene

2.4 靈敏性試驗

以稀釋好的拷貝數(shù)為1×100～1×107拷貝/μL質(zhì)粒標準品為模板，根據(jù)各稀釋度Ct值比較得出相應(yīng)的檢測范圍。β-actin、Mx1、OAS的檢測下限為100個拷貝。結(jié)果表明，該方法具有良好的敏感性，可以用于細胞因子相對表達量的分析中。

2.5 重復(fù)性試驗

將每個樣品每次3個重復(fù)進行qPCR反應(yīng)。各細胞因子所有反應(yīng)管平均Ct值相似，變異系數(shù)均在5%以內(nèi)，說明該反應(yīng)體系重復(fù)性較好(表2)。

2.6 對干擾素添加濃度、作用時間的篩選

通過比較不同α-IFN刺激時間、不同α-IFN終濃度下各個基因的相對表達量，最終篩選出最佳添加終濃度為750 U/mL和作用時間為24 h。

表2 目的基因組間重復(fù)性實驗結(jié)果Table 2 The result of reproducibility of the experiments for target genes

2.7 PCV2對PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子mRNA水平的影響

以未作任何處理的PK-15細胞作為對照，PK-15接種PCV2 24 h后用α-IFN處理，處理24 h后提取細胞總RNA進行qPCR檢測。通過統(tǒng)計學(xué)分析，PCV2能夠明顯降低Mx1、OAS基因的mRNA的相對表達量，如圖3所示。

圖3 PK-15細胞接種PCV2后各目的基因的相對表達量Fig.3 The relative mRNA expression level of target genein PK-15 cells infected with PCV2

3 討 論

qPCR方法不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏度高、準確性好和線性域值寬等優(yōu)點，已逐漸應(yīng)用于基因的表達的研究等諸多領(lǐng)域。但是，作為細胞因子研究熱點，有關(guān)PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子的實時熒光定量檢測方法并未見相關(guān)報道，因此本研究建立了用于PK-15細胞α-IFN效應(yīng)因子SYBR GreenI qPCR的檢測方法，并利用建立的方法對PCV2抑制α-IFN發(fā)揮效應(yīng)的信號通路進行了初步研究。

PCV2是一種無囊膜、單股環(huán)狀DNA病毒，能夠引起斷奶豬多系統(tǒng)綜合征等多種疾病，其典型臨床癥狀主要表現(xiàn)為體重下降、皮膚蒼白、呼吸困難以及黃疸，能夠感染仔豬和育肥豬并發(fā)病[9]。其典型的病變是淋巴組織內(nèi)伴隨著組織細胞浸潤的淋巴細胞減少，肺、肝、腎、心和腸等不同器官的肉芽腫[10-11]。目前，PCV2通過JAK-STAT信號通路抑制機體α-IFN產(chǎn)生的機制未見深入研究。本研究利用建立的SYBR Green I qPCR檢測方法，檢測PK-15細胞在感染PCV2后α-IFN效應(yīng)因子Mx1、OAS的mRNA水平，結(jié)果表明PCV2能夠明顯降低Mx1、OAS基因的mRNA的相對表達量，這為進一步研究PCV2抑制α-IFN發(fā)揮效應(yīng)的信號通路特別是JAK-STAT信號通路的機理奠定了基礎(chǔ)。

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