魏良浩 潘 慶 張躍明

（1.浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德醫(yī)院，浙江 杭州 310012）

阿爾茨海默病（AD）也稱老年性癡呆癥，是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，主要障礙表現(xiàn)在記憶上，患者關于自己記憶能力的知識受損，從而不能及時更新個人數(shù)據(jù)庫，被認為與額葉有關［1］。神經(jīng)營養(yǎng)因子-3（NT-3）廣泛分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，具有阻止胚胎期和出生后運動神經(jīng)元細胞死亡、支持感覺和運動神經(jīng)元的存活等功能，給記憶障礙的老齡鼠注射NT-3，有助于其記憶能力的恢復。在阿爾茨海默病中NT-3 Gly（63）～Glu突變明顯高于正常人［2］。因此，本實驗通過對AD大鼠額葉皮質(zhì)的NT-3陽性細胞數(shù)進行分析，研究《金匱》腎氣丸對AD的防治作用。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性清潔級SD大鼠30只，體質(zhì)量（250±20）g，購于浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心。

1.2 藥物與試劑 《金匱》腎氣丸（生地黃24 g，山茱萸肉 12 g，山藥 12 g，牡丹皮 9 g，澤瀉 9 g，桂枝 12 g，淡附子12 g）購于浙江中醫(yī)藥大學第一門診部，煎成3 g/mL藥液，放入無菌容器中4℃保存?zhèn)溆?。Aβ25-35peptide（北京博奧森生物技術公司），一抗NT-3（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1293），即用型SP試劑盒 （上海長島生物技術有限公司，編號：D-3005），DAB顯色試劑盒 （上海長島生物技術有限公司，編號：FL-6001）。

1.3 分組與造模 適應性飼養(yǎng)1周后，將大鼠隨機分3組：正常對照組，AD模型組，中藥治療組，每組10只。模型組及中藥治療組大鼠用2%的戊巴比妥鈉（45 mg/kg）麻醉后，固定在腦立體定位儀上，精確定位右側(cè)海馬CA2區(qū) （前囟后 4.2 mm，右側(cè)2 mm，深2.6 mm），頭頂備皮，切開皮膚，在顱骨上用牙鉆打孔至海馬區(qū)注射點，用10 μL微量注射器一次性注入2 μL 凝聚態(tài)的 Aβ25～35 （1 mg的 Aβ25～35 用無菌生理鹽水溶解，-20℃保存，實驗前將Aβ25～35溶液在37℃保溫箱中放置7 d以形成聚集態(tài)的Aβ25～35），5 min內(nèi)注完，留針3 min以保證溶液充分彌散后緩慢撤針。用牙托粉填補針孔，縫合皮膚并消毒。正常對照組在海馬內(nèi)注射同等劑量的生理鹽水。單籠飼養(yǎng)至大鼠完全清醒。中藥防治組在造模前15 d開始至成模后4周每日以9.9 g/kg的生藥量灌胃，每日1次。正常對照組和AD模型組在造模后給予等量的生理鹽水灌胃。造模成功4周后，大鼠用2%戊巴比妥鈉（45 mg/kg）腹腔注射麻醉，開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管快速灌注生理鹽水，同時剪開右心耳，待肝臟變白后，改灌4%多聚甲醛固定液 （用pH7.2～7.4的PBS配制）500 mL至大鼠尾巴變硬為灌注成功，開顱取腦，入相同固定液（4℃）后固定24 h。然后經(jīng)乙醇梯度脫水，透明，石蠟包埋，選取含額葉皮質(zhì)的腦塊制作冠狀連續(xù)切片。

1.4 標本采集與檢測 每組動物各取7只，每只在相應的額葉部位連續(xù)切片，隔五取一，共取15張切片，按照包新民圖譜的B-0.4至B-1.6平面中的Prcl區(qū)和Prcm區(qū)，在裝有目鏡網(wǎng)格400倍視野下進行陽性細胞計數(shù)，計算出0.01 mm2單位面積內(nèi)的NT-3陽性神經(jīng)元數(shù)目作為NT-3陽性細胞密度。選取各組同一平面含額葉皮質(zhì)的切片，將切片脫蠟水化（二甲苯3 min×2次，100%酒精 3 min，95%酒精 3 min，80%酒精 3 min，70%酒精3 min，蒸餾水5 min），室溫下將切片放入現(xiàn)配0.3%雙氧水溶液中，室溫孵化7 min滅活內(nèi)源性酶，放入 Phosphate Buffered Saline（PBS）緩沖液（pH7.2～7.6）洗滌2 min×3次，再進行隔水熱抗原修復，然后按照SP試劑盒說明書進行染色（NT-3一抗?jié)舛龋?∶50）， 最后脫水至透明 （70%酒精 3 min，80%酒精 3 min，90%酒精 3 min，95%酒精 3 min，100%酒精 5 min×2次，二甲苯3 min×2次，中性樹膠封片。陰性對照組用Phosphate Buffered Saline（PBS）緩沖液液代替一抗。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，所得數(shù)據(jù)以（）表示。統(tǒng)計各組染色的陽性神經(jīng)細胞密度，采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況 觀察各組大鼠在術前行為均正常，反應靈敏，正常進食。術后3～6 d后，正常對照組恢復正常，中藥組和AD模型組出現(xiàn)相應的反應遲鈍，精神萎靡，喜靜少動，少食少飲。術后10 d左右，模型組大鼠反應仍舊遲鈍，覓食減少，中藥組較模型組而言，精神癥狀較好，覓食增加。

2.2 各組大鼠額葉皮質(zhì)NT-3免疫組化結果 見圖1。AD模型組大鼠Prcl和Prcm區(qū)中的額葉皮質(zhì)NT-3神經(jīng)元數(shù)量少（與正常組比較P<0.01），染色淺；正常對照組的Prcl和Prcm區(qū)中的額葉皮質(zhì)NT-3神經(jīng)元數(shù)量多，染色深，輪廓清楚；中藥治療組大鼠與正常對照組接近。目鏡網(wǎng)格法測的的各組大鼠額葉皮質(zhì)陽性細胞密度見表1。

表1 各組大鼠額葉皮質(zhì)陽性細胞密度比較（細胞數(shù)/0.01 mm2，）

表1 各組大鼠額葉皮質(zhì)陽性細胞密度比較（細胞數(shù)/0.01 mm2，）

與正常對照組比較，*P＜0.01。

圖1 免疫組化結果（×400）

3 討 論

AD患者常有認知功能障礙，主要表現(xiàn)為學習、記憶能力下降。額葉皮質(zhì)神經(jīng)元與各葉皮質(zhì)均有往返聯(lián)系，額葉神經(jīng)元通過抑制無關信息、選擇性注意和語詞輸出等機制介入知覺型聯(lián)想啟動和知覺啟動，從而參與學習記憶過程［3］。NT-3是一組與神經(jīng)結構和功能密切相關的蛋白，其營養(yǎng)信息的傳遞是通過具有高親和力活性的酪氨酸激酶受體來啟動的，調(diào)控著神經(jīng)元的發(fā)育、生長、分化和生存，對維持神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能承擔著重要作用［4-5］。本研究結果顯示，NT-3陽性細胞在額葉皮質(zhì)各層內(nèi)彌散分布，與正常對照組比較，AD模型組大鼠大腦皮質(zhì)NT-3陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，染色變淺，表明AD大鼠的額葉皮質(zhì)表達NT-3的神經(jīng)元發(fā)生了退行性變。

《金匱》腎氣丸載于東漢醫(yī)家張仲景所著的《金匱要略》，分別主治虛勞、消渴、腳氣、痰飲、轉(zhuǎn)胞5個病證，乃公認的補腎名方。老年人的生理特點和病理基礎多是腎氣虛損，腎精虧虛，不能生髓充腦，腦失滋養(yǎng)，漸成癡呆，故補腎法是治療老年性癡呆的重要方法。本實驗結果顯示，老年性癡呆模型組大鼠額葉皮質(zhì)NT-3陽性神經(jīng)細胞表達減少，陽性細胞密度比正常對照組降低，《金匱》腎氣丸治療組陽性細胞密度與正常對照組接近。因此，筆者推測以額葉皮質(zhì)Prcl區(qū)和Prcm區(qū)為代表的老年性癡呆大鼠模型較正常大鼠額葉皮質(zhì)存在較少的NT-3陽性細胞，《金匱》腎氣丸能夠通過抑制NT-3的陽性細胞的凋亡，起到延緩神經(jīng)元衰老死亡的作用，從而對老年性癡呆能起到一定的防治作用。增加的NT-3又能降低細胞內(nèi)活性氧的水平或改變活性氧組份比例起到保護細胞的作用，并通過影響細胞內(nèi)多種蛋白酶、激酶及其復雜的信號傳遞系統(tǒng)來抑制細胞凋亡的過程［6］。

綜上所述，《金匱》腎氣丸對老年性癡呆大鼠大腦額葉皮質(zhì)神經(jīng)元的退變具有一定的防治作用。

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