田曉 孟曉華 董科 馮曉明 徐潺 王玉潯 史國(guó)輝

(唐山河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，063000)

腎間質(zhì)纖維化是各種腎臟疾病進(jìn)入終末期的共同病理損害，采取各種措施阻止腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生是臨床防治腎小管間質(zhì)病變、保護(hù)腎功能的重要目標(biāo)之一。以往對(duì)多種中藥單味藥或復(fù)方制劑的研究均顯示中藥可能在不同的慢性腎臟病治療中具有改善腎功能、減輕腎間質(zhì)纖維化的功效。本研究目的在于對(duì)于腎康注射液的抗腎臟纖維化作用的探討。

1 材料與方法

1.1 藥品 纈沙坦膠囊由諾華制藥公司提供，腎康注射液由西安世紀(jì)盛康藥業(yè)有限公司提供。本研究中選用的藥物劑量均為以往相關(guān)研究已證實(shí)的有效劑量[1-2]。

1.2 主要試劑 第一抗體包括兔抗人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1、小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白。第二抗體為生物素標(biāo)記的山羊抗兔lgG(ZB 2010)及馬抗小鼠lgG(ZB 2020)，均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。第三抗體為辣根過氧化物酶耦聯(lián)璉卵白素(福州邁新生物有限公司)。顯色底物為DAB(福州邁新生物有限公司)。

1.3 動(dòng)物模型制備與標(biāo)本收集 雄性SD大鼠36只(SPF級(jí)，河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量(270±10)g，隨機(jī)分為3組(每組12只)，腎康組：術(shù)前1 d及術(shù)后給予腎康注射液，20 mL/支，每支內(nèi)含原生藥6 g，按10 g/(kg·d)，腹腔注射每天一次(08：00—09：00)；纈沙坦組：纈沙坦混懸液30 mg/(kg·d)，每天一次(08：00—09：00)1 mL灌胃；模型組(UUO組)：每天同體積的生理鹽水灌胃。

UUO模型的制備參照文獻(xiàn)[2]方法。各藥物治療組均于術(shù)前1 d開始用相應(yīng)藥物等量灌胃，UUO組以等量自來水灌胃。術(shù)后第14天處死各組大鼠12只，心臟取血制備血清，－80℃冰箱保存待測(cè)腎功能指標(biāo)，梗阻側(cè)經(jīng)腎門正切的腎組織用10%中性甲醛溶液固定、常規(guī)方法制備切片。

1.4 病理學(xué)觀察 病理學(xué)觀察腎組織切片行HE染色、免疫組織化學(xué)染色，單盲法于光鏡下觀察HE染色切片皮質(zhì)腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小管擴(kuò)張、萎縮和纖維化等病理改變。

1.5 腎功能測(cè)定 腎功能測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀(BECKMANCOUL TERL×20)測(cè)定血清肌酐(Scr)和尿素氮(BUN)及電解質(zhì)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠生化指標(biāo)的變化(表1) 由表1可知第14天時(shí)3組大鼠的腎功能及電解質(zhì)均有升高，但模型組(UUO)升高更明顯，兩個(gè)用藥組(腎康、纈沙坦)雖有升高，但更接近正常值，模型組與兩個(gè)用藥組(腎康、纈沙坦)腎功能和電解質(zhì)之間有明顯變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，兩個(gè)用藥組(腎康、纈沙坦)腎功能和電解質(zhì)之間沒有明顯變化，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，所有指標(biāo)中以BUN、Scr、P3+變化最為明顯。

2.2 腎臟病理改變 光鏡下可見(HE)。實(shí)驗(yàn)第14天，模型組腎間質(zhì)炎細(xì)胞呈彌漫性浸潤(rùn)，局灶性加重，腎小管明顯擴(kuò)張，上皮腫脹，空泡變性，并出現(xiàn)間質(zhì)纖維化；而腎康組及纈沙坦組的變化相仿，間質(zhì)內(nèi)炎細(xì)胞則呈小灶性浸潤(rùn)，少許上皮細(xì)胞腫脹，少部分腎小管輕度擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維化明顯較模型組輕。

2.2.1 TGF-β1在腎間質(zhì)的表達(dá)(表2) UUO組：TGF-β1在皮層間質(zhì)細(xì)胞漿中表達(dá)增多，小管上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，一直處于較高水平。兩個(gè)治療組：TGF-β1在皮層間質(zhì)細(xì)胞中較UUO同期表達(dá)有所減少。半定量分析顯示：兩個(gè)治療組腎小管間質(zhì)中TGF-β1表達(dá)均低于同期UUO(P＜0.05)，腎康組與纈沙坦組在抑制UUO鼠腎小管TGF-β1表達(dá)的作用相似，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.2.2 α-SMA在腎間質(zhì)的表達(dá) (表2) UUO組可見α-SMA在腎間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)為主，部分腎小管上皮細(xì)胞中也有表達(dá)，維持較高水平。兩個(gè)治療組呈局灶性沉積，半定量分析顯示：腎小管間質(zhì)中α-SMA表達(dá)均低于同期UUO(P＜0.05)，腎康組與纈沙坦組在抑制UUO鼠腎小管α-SMA表達(dá)的作用相似，兩組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 第14天3組大鼠腎功能、電解質(zhì)指標(biāo)比較(±s)

表1 第14天3組大鼠腎功能、電解質(zhì)指標(biāo)比較(±s)

注：與模型組比較，▲ P＜0.05

項(xiàng)目 BUN Scr K+ Na+ cl- Ca2+ P3+ Mg2+ 模型組 24.18±9.86 158.33±19.16 5.11±0.30 140.57±1.75 98.73±0.79 2.33±0.84 2.14±0.30 1.35±0.15腎康組 10.87±2.50▲ 100.00±32.50▲ 5.11±0.17 136.65±4.90 96.77±2.72 2.45±0.16 1.15±0.19▲ 1.20±0.26纈沙坦組 10.89±1.75▲ 108.50±29.04▲ 5.26±0.23 140.22±2.53 98.45±1.89 2.45±0.28 1.16±0.19▲ 1.14±0.37

表2 第14天各組大鼠腎小管間質(zhì)表達(dá)TGF-β1、α-SMA的比較(±s)

表2 第14天各組大鼠腎小管間質(zhì)表達(dá)TGF-β1、α-SMA的比較(±s)

注：與模型組比較，▲ P＜0.05

組別 TGF-β1 a-SMA模型組 2.33±0.82 2.00±0.63纈沙坦組 0.92±0.58▲ 1.00±0.55▲ 腎康組 0.83±0.26▲ 0.67±0.41▲

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是所有慢性腎臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路，是導(dǎo)致慢性腎功能衰竭(CRF)的病理學(xué)基礎(chǔ)，尋求其早期可逆因子或防治措施對(duì)腎臟疾病轉(zhuǎn)歸有重要意義[3]。在本研究中，我們分別觀察了腎小管間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的標(biāo)志物α-SMA表達(dá)、促纖維化因子TGF-β1表達(dá)在UUO所致腎間質(zhì)纖維化中的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎康注射液可以使腎小管和腎間質(zhì)α-SMA表達(dá)減少，抑制腎小管上皮TGF-β1的表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)腎康注射液可以明顯改善UUO模型鼠的腎功能，表現(xiàn)為用藥后Scr和BUN水平較模型組明顯降低。這些結(jié)果證實(shí)腎康注射液在腎臟疾病中確實(shí)具有抗纖維化作用。腎康注射液復(fù)方中藥注射液，其主要成分為大黃、黃芪、丹參、紅花。方中大黃為主藥可通腑泄?jié)?，具消除水腫，降低血肌、尿素氮，延緩腎小管間質(zhì)纖維化的功效。大黃不僅能降低血液中尿素氮的水平，改善慢性腎衰竭病人的臨床癥狀，還可使細(xì)胞外基質(zhì)合成減少和降解增加，降低血壓，增加毛細(xì)血管的通透性，以及減輕腎硬化，延緩慢性腎衰竭的發(fā)生發(fā)展[4-5]。黃芪主要含黃芪多糖、氨基酸、蛋白質(zhì)和大量無機(jī)離子，具有擴(kuò)張血管，降低血壓，加強(qiáng)造血功能，增加腎血流量，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的功能。此外，黃芪可抑制TGF-β1的產(chǎn)生，延緩腎功能惡化，保護(hù)腎功能。大黃助胃降濁[6]，黃芪助脾升清，脾胃升降有力，可使腎功能惡化延緩。張東亮等[7-9]在腺嘌呤致腎間質(zhì)纖維化大鼠動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)，用復(fù)方丹參合劑，可下調(diào)TGF-β1的表達(dá)，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的生成，具有抗腎間質(zhì)纖維化的作用。通過本實(shí)驗(yàn)可知腎康注射液能抑制單側(cè)輸尿管結(jié)扎大鼠腎間質(zhì)中TGF-β1和α-SMA的過度表達(dá)，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用[10-12]。綜上所述，腎康注射液可作用于腎間質(zhì)纖維化的早期，可以通過抑制TGF-β1的活性，減少α-SMA的表達(dá)，從而達(dá)到其對(duì)腎間質(zhì)纖維化的抑制作用。由于腎康注射液具有療效佳、副作用小等特點(diǎn)，因而對(duì)于延緩慢性腎臟疾病向終末期腎功能衰竭發(fā)展有一定的臨床指導(dǎo)意義，是一種很有前景的藥物，值得繼續(xù)深入研究。

[1]王海燕，李驚子，潘輯圣，等.中藥黃芪當(dāng)歸合劑對(duì)腎病綜合征腎損傷的保護(hù)作用及對(duì)代謝紊亂的影響[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2002，34(5)：542-552.

[2]Diamond JR，Levinson M，Kreisberg R，et al.Increased expreesion of TGF-β1mRNA in the obstructed kidney of rats with unilateral ureteral ligation[J].Kidney Int，1997，51(4)：1133-1139.

[3]崔俊起，韓平杰.腎康注射液對(duì)早期糖尿病腎病的治療觀察[J].中國(guó)誤診學(xué)雜志，2008，8(9)：2996-2097.

[4]張志英，董利平，楊海燕.丹紅注射液對(duì)糖尿病患者血液流變學(xué)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18(9)：2272-2273.

[5]呂莉，李欣燕，韓國(guó)柱，等.重組水蛭素體內(nèi)抗凝活性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中草藥，2002，33(6)：520-522.

[6]柯凌.大黃的藥理及其在腎臟病中的運(yùn)用[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2001，2(6)：347-348.

[7]張東亮，王質(zhì)剛.復(fù)方丹參合劑對(duì)腎間質(zhì)纖維化影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2004，4(7)：509-511.

[8]水華，徐聯(lián)芳，陳德基.纈沙坦對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎臟的保護(hù)作用[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2004，25(6)：708-710.

[9]孫世瀾，周朝陽.腎臟病理論與實(shí)踐[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2005：4.

[10]王玉，李曉政.α-肌動(dòng)蛋白在腎系膜細(xì)胞重塑過程中的變化及其意義[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)：泌尿系統(tǒng)分冊(cè)，1997(4)：172-175.

[11]Lijnen HR.Pleiotropic functions of plasminogen activator inhibitor-1[J].J Thromb Haemost，2005，3(1)：35-45.

[12]Muller GA，Zeisberg M，Strutz F，et al.The importance of tubulointerstitial damage in progressive renal disease[J].Nephrol Dial Transplant，2000，15(suppl 6)：76-77.