付蘇雷 楊慈清 賈陽(yáng)陽(yáng) 李 晗 郭志坤 林俊堂

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新鄉(xiāng)453003)

高等動(dòng)物的大腦皮層是一個(gè)高度組織、由多層神經(jīng)細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)合體，神經(jīng)發(fā)生始于胚胎期的室管膜區(qū)和室管膜下區(qū)，此處的神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化為神經(jīng)前體細(xì)胞，再向外遷移逐步分化和成熟形成皮層板的各層神經(jīng)元細(xì)胞。這種遷移是一個(gè)神經(jīng)元由內(nèi)至外的裝配過程，即inside-out的過程［1］，這個(gè)發(fā)育過程受到嚴(yán)格的調(diào)控以確保建立正確的、有功能的大腦皮層。一旦皮層發(fā)育異常，特別是神經(jīng)元遷移異常，就會(huì)對(duì)大腦功能產(chǎn)生影響，造成諸如精神分裂癥、癲癇、自閉癥等多種疾病。

神經(jīng)鈣黏蛋白(Neural cadherin，N-Cadherin)最先在雞胚胎神經(jīng)管中被發(fā)現(xiàn)，是鈣黏連蛋白家族中第一個(gè)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的成員。有研究表明，N-Cadherin介導(dǎo)了細(xì)胞間黏附及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有識(shí)別細(xì)胞、調(diào)控組織器官形態(tài)發(fā)生等生物學(xué)功能。Tan等［2］發(fā)現(xiàn)神經(jīng)電活動(dòng)依賴的樹突形態(tài)發(fā)生需要NCadherin介導(dǎo)的神經(jīng)元之間的相互作用，并且NCadherin依賴的神經(jīng)元之間的相互接觸在新生樹突維持過程中具有特異作用。Masakazu等［3］通過條件性基因敲除小鼠證明N-Cadherin沉默后的小鼠大腦皮層沒有明顯的層狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)分層混亂的現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)利用小鼠活體子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)基因(In utero electroporation，IUE)技術(shù)，將雞源性的 N-Cadherin轉(zhuǎn)染到E15胎鼠的大腦皮層，實(shí)現(xiàn)異源性N-Cadherin的超表達(dá)，結(jié)合RNA干擾技術(shù)實(shí)現(xiàn)N-Cadherin的抑制表達(dá)，用GFP作為示蹤，采用熒光免疫組化綜合分析N-Cadherin異常表達(dá)對(duì)小鼠胚胎發(fā)育過程大腦皮層神經(jīng)元遷移的影響，為研究N-Cadherin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 本實(shí)驗(yàn)所用小鼠由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供;雞源pCAGGS-N-Cadherin真核表達(dá)質(zhì)粒和pCAGGS-GFP(綠色熒光蛋白)質(zhì)粒由Redies教授饋贈(zèng)，shRNA干擾載體pGPU/GFP/Neomouse-N-Cadherin-shRNA由百奇生物科技有限公司合成構(gòu)建，DAPI購(gòu)自羅氏公司，Rabbit anti N-Cadherin抗體(識(shí)別雞源組織)由Redies教授饋贈(zèng);二抗為Goat anti Rabbit Cy3標(biāo)記(Molecular Probes);CUY-21型多功能活體電轉(zhuǎn)化儀(日本 NEPA公司);M205FA型倒置體視熒光顯微鏡(德國(guó) Leica公司);Nikon ECLIPSE 80i熒光顯微鏡(日本);CM1850型冷凍切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 同源性比較 從Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中查到小鼠 N-Cadherin(NCBI No.NM_007664.4)的 CDS序列有2 721 bp，其對(duì)應(yīng)的氨基酸為906個(gè);雞N-Cadherin(NCBI No.NM_001001615.1)的 CDS序列有2 739 bp，其對(duì)應(yīng)的氨基酸為912個(gè)，且與本實(shí)驗(yàn)所用真核表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS-N-Cadherin中N-Cadherin序列一致。利用DNAman7.0生物軟件比較兩物種N-Cadherin的CDS序列和氨基端序列同源性。

1.2.2 小鼠子宮內(nèi)電轉(zhuǎn) 將健康成年小鼠雌雄各1只于第一天晚上7點(diǎn)合籠，第二天早上7點(diǎn)檢查雌鼠是否有陰道栓，有陰道栓記為懷孕0.5天(胎鼠E0.5)，第三天 7點(diǎn)記為懷孕 1.5天(胎鼠E1.5)，以此類推。取懷孕15天的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將孕鼠用4.3%的水合氯醛按照0.01 ml/g體重腹腔注射，注射時(shí)避免扎到胚胎;約5分鐘后小鼠被麻醉，剔除腹部中線附近被毛，然后腹部朝上固定于超凈工作臺(tái)內(nèi)37℃加熱墊的手術(shù)墊單上，用75%的酒精棉球和碘酒給孕鼠腹部徹底消毒，用無菌的手術(shù)器械沿腹中線剪開一個(gè)大約2～3 cm長(zhǎng)的小口，取出兩側(cè)子宮，并不斷在子宮上滴加37℃已加抗生素的生理鹽水，保持子宮濕潤(rùn);用顯微注射毛細(xì)玻璃針吸取準(zhǔn)備好的質(zhì)粒0.5～1 μl準(zhǔn)確注射到胎鼠側(cè)腦室，再把電轉(zhuǎn)儀板狀電極的正負(fù)兩極分別放在胎鼠的左右腦，正極在擬轉(zhuǎn)基因一側(cè);使用電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電擊，電轉(zhuǎn)電壓35 V，每次電擊時(shí)間60 ms，間隔時(shí)間600 ms，電脈沖數(shù)5次，從子宮頸口胚胎向兩側(cè)計(jì)數(shù)，記錄轉(zhuǎn)染胚胎位置，每側(cè)子宮轉(zhuǎn)染1～2個(gè)胚胎，轉(zhuǎn)染完成后把子宮放回腹腔，將創(chuàng)口縫合并放在37℃加熱墊上，手術(shù)2～3小時(shí)后小鼠恢復(fù)清醒。小鼠存活5天后，將其處死，根據(jù)記錄位置，取出轉(zhuǎn)染胚胎，在體視熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，電轉(zhuǎn)部位呈現(xiàn)綠色熒光者(GFP顏色)視為陽(yáng)性。

1.2.3 取材及切片 取體視熒光顯微鏡下觀察為陽(yáng)性表達(dá)的胚胎，在普通體視顯微鏡下，采用尖頭鑷子小心去除皮膚和腦骨膜，用腦小鏟從腦干向嗅球的方向完整取出整個(gè)腦組織，轉(zhuǎn)移至4℃預(yù)冷處理的PBS液漂洗2～3次，浸沒于裝有4%PFA(多聚甲醛)的EP管中，置保溫盒冰塊中搖床搖晃過夜，次日取出組織，吸干液體，轉(zhuǎn)移到18%蔗糖溶液置冰盒中搖晃過夜，待組織沉淀到管底時(shí)取出組織吸干液體，根據(jù)組織大小，用錫箔紙做好模型，用OCT包埋，注意方向，嗅球朝上腦干朝下，確定好位置，置于液氮中冷凍后放－80℃冰箱保存，切片時(shí)取出已包埋的組織，在冰凍切片機(jī)上冠狀連續(xù)切片，厚度20 μm，切片后置烤片機(jī)上，37℃烤片30分鐘以上，放－80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 熒光免疫組織化學(xué)染色 從－80℃冰箱中取出冰凍切片40℃干燥20分鐘，4%PFA中4℃固定15分鐘，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘，在含0.1%Triton X-100的1×TBS中再孵育5分鐘。每張載玻片上加1 ml免疫組化封閉液，濕盒中孵育1小時(shí)。去除封閉液后每張載玻片加300 μl用封閉液稀釋的合適濃度Rabbit anti N-Cadherin(1∶500)一抗，4℃孵育過夜后，1×TBS清洗3次，每次5分鐘，然后每張片加300 μl用封閉液稀釋的Cy3標(biāo)記的Goat anti Rabbit二抗，室溫孵育1小時(shí)后，用1×TBS清洗3次，每次5分鐘。最后滴加DAPI封片劑染色10分鐘，加蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 圖像處理分析 用Photoshop CS3軟件處理圖片，可將2種染色同位疊加在一起，從而分析蛋白質(zhì)的表達(dá)定位。

2 結(jié)果

2.1 雞源與鼠源N-cadherin同源性比較結(jié)果 借助DNAman7.0生物軟件對(duì)兩物種 N-Cadherin的CDS序列和各自編碼氨基端序列進(jìn)行同源性比較，同源相似性分別為77.25%和85.42%，說明二者為來自不同物種的同源基因。

2.2 雞源性N-cadherin超表達(dá)對(duì)小鼠大腦皮層發(fā)育過程神經(jīng)元遷移的影響 從圖(1A-C)中可以看出，在胚胎發(fā)育的E15時(shí)轉(zhuǎn)染pCAGGS-GFP后，E20時(shí)取材切片，被轉(zhuǎn)染GFP陽(yáng)性表達(dá)的神經(jīng)元從內(nèi)向外遷移，大多數(shù)已遷移到皮層Ⅱ-Ⅳ層(圖1B)，同時(shí)在Ⅴ-Ⅵ層也有部分神經(jīng)元，在亞室管膜(Subventrical zone，SVZ)也存在大量GFP陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞。將雞源性pCAGGS-N-Cadherin表達(dá)載體與pCAGGSGFP共轉(zhuǎn)染后，從圖(1D-F)中可以看到，雞源性NCadherin在小鼠大腦皮層中能夠?qū)崿F(xiàn)超表達(dá)(圖1D)，實(shí)驗(yàn)中Rabbit anti N-Cadherin單克隆抗體不能夠與鼠N-Cadherin結(jié)合，圖(1D)中紅色標(biāo)記的即為雞源性N-Cadherin超表達(dá)結(jié)果，N-Cadherin實(shí)現(xiàn)超表達(dá)后E20時(shí)(圖1D-F)可以看出大多數(shù)神經(jīng)元已經(jīng)遷移到Ⅱ-Ⅳ層，與對(duì)照組相比，GFP標(biāo)記的神經(jīng)元在Ⅴ-Ⅵ層和SVZ區(qū)的數(shù)量較少。

圖1 活體子宮內(nèi)對(duì)胎鼠大腦皮層電轉(zhuǎn)N-Cadherin及其shRNAFig.1 N-Cadherin and its shRNA transfection into mouse embryonic cerebral cortex with in utero electroporation

2.3 N-cadherin抑制表達(dá)對(duì)小鼠大腦皮層發(fā)育過程神經(jīng)元遷移的影響 針對(duì)小鼠N-Cadherin上的GCCTATGAAGGAACCACATGA靶序列設(shè)計(jì)shRNA干擾載體(pGPU/GFP/Neo-mouse-N-Cadherin-shRNA)，該載體自身攜帶有GFP報(bào)告基因，但在預(yù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)轉(zhuǎn)染該載體所表達(dá)的GFP熒光非常微弱，很難檢測(cè)到綠色熒光，因此我們將能強(qiáng)表達(dá)GFP的pCAGGS-GFP質(zhì)粒與其共轉(zhuǎn)，且shRNA干擾載體與 pCAGGS-GFP質(zhì)粒的濃度比為8∶1，確保pCAGGS-GFP轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同時(shí)也被shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染。從圖(1G-I)中可以看到，將shRNA干擾載體與pCAGGS-GFP質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后E20時(shí)，大量GFP陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞停留在SVZ區(qū)，很少有細(xì)胞遷移到Ⅱ-Ⅳ層，與對(duì)照組相比(圖1A-C)存在明顯差別。

3 討論

本研究中利用小鼠子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)基因技術(shù)將帶有強(qiáng)啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體pCAGGS-N-Cadherin和帶有干擾片段的shRNA干擾載體轉(zhuǎn)染到胎鼠的室管膜區(qū)，由此實(shí)現(xiàn)了對(duì)N-Cadherin的超表達(dá)和抑制表達(dá)。有研究表明對(duì)E10.5～E11.5胎鼠用放射性標(biāo)記物標(biāo)記室管膜的細(xì)胞，被標(biāo)記的神經(jīng)元最終大部分位于較深的板層中，在E12.5～E13.5標(biāo)記的細(xì)胞，最終位于皮層中間的板層中，在E15.5～E16.5標(biāo)記的細(xì)胞，最終位于皮層的第Ⅱ板層［4，5］。由于是對(duì)E15的胎鼠進(jìn)行電轉(zhuǎn)，此時(shí)的神經(jīng)元應(yīng)該遷移到皮層的Ⅱ～Ⅳ層，從我們實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組中也可以看到同樣的結(jié)果;與對(duì)照組相比，N-Cadherin超表達(dá)后促進(jìn)了神經(jīng)元的遷移，有更多GFP標(biāo)記的神經(jīng)元遷移到Ⅱ～Ⅳ層;然而N-Cadherin被干擾后阻礙了神經(jīng)元的遷移，被標(biāo)記神經(jīng)元明顯停滯在室管膜區(qū)。我們把能夠強(qiáng)烈表達(dá)GFP的質(zhì)粒與目的質(zhì)粒(濃度比為1∶8)混合共轉(zhuǎn)染，保證了目的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞同時(shí)也被GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，GFP作為報(bào)告基因?qū)τ^察神經(jīng)元的遷移狀況很方便，而且GFP的表達(dá)對(duì)胚胎的發(fā)育不存在影響［6］。在條件性基因敲除小鼠模型中N-Cadherin沉默小鼠大腦皮層出現(xiàn)了混亂狀態(tài)，完全失去了正常的層的結(jié)構(gòu)，而且皮層中有絲分裂細(xì)胞的分布也出現(xiàn)異常，可見N-Cadherin在神經(jīng)細(xì)胞遷移過程中具有非常重要的作用［3］。但是N-Cadherin不是唯一一個(gè)對(duì)大腦皮層發(fā)育和神經(jīng)元遷移起作用的分子，潘樂等［7］結(jié)合RNA干擾和子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)DAM17對(duì)于小鼠大腦皮層發(fā)育中期神經(jīng)前體細(xì)胞向外側(cè)遷移是必需的，干擾ADAM17的表達(dá)會(huì)造成神經(jīng)前體細(xì)胞滯留在腦室區(qū)和腦室下區(qū);神經(jīng)元的向外遷移分為膠質(zhì)細(xì)胞依賴型和非膠質(zhì)細(xì)胞依賴型兩種，研究表明在非膠質(zhì)細(xì)胞依賴型的神經(jīng)元遷移中，Reelin調(diào)控Dap1激活Rap1，Rap1調(diào)節(jié)N-Cadherin表達(dá)，進(jìn)而控制神經(jīng)元的遷移和定位［8，9］;Robo4在皮層神經(jīng)元的放射狀遷移中具有重要的作用，上調(diào)皮層中新生神經(jīng)元的Robo4表達(dá)導(dǎo)致新生神經(jīng)元的放射狀遷移出現(xiàn)嚴(yán)重缺陷［10］;可能還有很多沒有被發(fā)現(xiàn)的分子起著重要的作用，他們共同構(gòu)成一個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來調(diào)控大腦皮層的發(fā)育。RNA干擾結(jié)合活體子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)基因方法與基因敲除技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)點(diǎn):①局部受到干擾后的胚胎可以繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育便于長(zhǎng)時(shí)間觀察受干擾細(xì)胞的生命活動(dòng)狀況，而基因敲除小鼠的靶基因整體被沉默，對(duì)于胚胎發(fā)育過程中功能必須的基因沉默常常在胚胎發(fā)育過程導(dǎo)致個(gè)體的死亡，使持續(xù)觀察受限;②可以通過質(zhì)?；旌瞎厕D(zhuǎn)染的方法特異性的研究?jī)蓚€(gè)及兩個(gè)以上基因的相互作用;③子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因的定時(shí)定位抑制表達(dá)，有利于在特定時(shí)間特定部位研究基因的功能。但是對(duì)于研究E12天以前與胚胎發(fā)育的相關(guān)分子，子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)技術(shù)也有其缺陷，因?yàn)閷?duì)懷孕不到12天的小鼠進(jìn)行電轉(zhuǎn)容易造成小鼠流產(chǎn)，很難獲得成功轉(zhuǎn)染的胚胎?？傊琋-Cadherin作為一種細(xì)胞間同種黏附的鈣依賴型跨膜糖蛋白，主要分布于神經(jīng)和肌肉組織，在神經(jīng)元的遷移定位、突觸的形成、神經(jīng)軸突的導(dǎo)向生長(zhǎng)及靶向識(shí)別中起重要作用，而且在受到干擾后沒有觀察到明顯的補(bǔ)償機(jī)制，因此我們可以選擇N-Cadherin作為關(guān)鍵分子，結(jié)合子宮內(nèi)電轉(zhuǎn)基因技術(shù)定時(shí)定位研究與其相關(guān)的上下游分子，進(jìn)而研究皮層發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1 Bystron I，Blakemore C，Rakic P.Development of the human cerebral cortex:boulder committee revisited［J］.Nat Rev Neurosci，2008;9(2):110-22.

2 Tan Z，Peng Y，Song H L et al.N-cadherin-dependent neuron-neuron interaction is required for the maintenance of activity-induced dendrite growth［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2010;107(21):9873-9878.

3 Masakazu M，Kadowaki S，Takeichi M et al.N-cadherin mediates cortical organization in the mouse brain［J］.Dev Biol，2007;304(1):22-33.

4 Nadarajab B，Parnavelas J G.Modes of neuronal migration in the developing cerebral cortex［J］.Nat Rev Neurosci，2002;3(6):423-432.

5 Kanatani S，Tabata H，Nakajima K.Neuronal migration in cortical development［J］.J Child Neurol，2005;20(4):274-279.

6 楊慈清，石曉衛(wèi)，林俊堂 et al.應(yīng)用雞胚活體電轉(zhuǎn)GFP示蹤技術(shù)觀察脊髓左右兩側(cè)神經(jīng)元纖維投射［J］.中國(guó)免疫學(xué)雜志，2012;28(8):718-721.

7 潘 樂，馬執(zhí)行，鄭煜芳.小鼠大腦皮層中ADAM17表達(dá)降低對(duì)神經(jīng)元前體細(xì)胞向外遷移的抑制作用［J］.復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2011;50(5):597-604.

8 Franco S J，Martinez-Garay I，Müller U et al.Reelin regulates cadherin function via Dab1/Rap1 to control neuronal migration and lamination in the neocortex［J］.Neuron，2011;69(3):482-97.

9 Jossin Y，Cooper J A.Reelin，Rap1 and N-cadherin orient the migration of multipolar neurons in the developing neocortex［J］.Nat Neurosci，2011;14(6):697-703.

10 Zheng W，Geng A Q，Yuan X B et al.Robo4 regulates the radial migration of newborn neurons in developing neocortex［J］.Cereb Cortex，2012;22(11):2587-601.