陳安平 袁國(guó)華 羅雄燕 楊明輝 劉素蘭

(湖北民族學(xué)院風(fēng)濕性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，恩施445000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種主要累及關(guān)節(jié)滑膜，以滑膜炎癥反應(yīng)、血管翳形成、軟骨及骨破壞為特征的一種常見的關(guān)節(jié)炎性疾病。DcR3是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤壞死因子誘騙受體，能與多種TNF家族成員如FasL、LIGHT、TL1A等結(jié)合，從而有效地抑制了相關(guān)腫瘤壞死因子所誘導(dǎo)的凋亡。近年來研究發(fā)現(xiàn)在許多自身免疫性疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、矽肺、系統(tǒng)性硬化癥等患者的外周血單核細(xì)胞及血清中也存在DcR3的高表達(dá)。RA是一種發(fā)病率和致殘率均較高的一種風(fēng)濕免疫性疾病，凋亡機(jī)制在RA的發(fā)病機(jī)制中占有重要地位。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)DcR3在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清及外周血單核細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高，而其血清表達(dá)水平在風(fēng)濕活動(dòng)較高的患者則更加明顯［1］。為了進(jìn)一步探討DcR3在RA患者滑膜組織中的表達(dá)情況，本文通過對(duì)RA患者滑膜組織用免疫組織化學(xué)方法行DcR3表達(dá)的研究，并同時(shí)用ELISA的方法研究了RA患者關(guān)節(jié)液中DcR3的表達(dá)情況，報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 滑膜組織標(biāo)本來自川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科2009年9月至2010年5月手術(shù)患者的切除標(biāo)本，其中RA患者12例，均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)分類標(biāo)準(zhǔn)，男性2例，女性10例，年齡26～69歲，平均(45±14)歲，病程2～12年。另有OA患者6例和無關(guān)節(jié)疾病的骨折患者4例作為對(duì)照。6例OA患者中男性2例，女性4例，年齡48～73歲，平均(60±11)歲，4例正?；ず蛙浌墙M織來自男性3名，女性1名。年齡24～52歲。所有滑膜組織切片均用蘇木素—伊紅(HE)染色。根據(jù)滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，將滑膜炎記為l～3分:炎性浸潤(rùn)細(xì)胞＜25個(gè)/視野為1分;炎性浸潤(rùn)細(xì)胞25～100個(gè)/視野為2分;炎性浸潤(rùn)細(xì)胞＞100個(gè)/視野為3分［2］。RA及OA患者關(guān)節(jié)液均取自膝關(guān)節(jié)，為2009年9月直2010年5月川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科的住院病人，其中 RA患者26例，均符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)分類標(biāo)準(zhǔn)，男性6例，女性20例，年齡45～72歲，平均(51±11)歲。另有OA患者19例，男性5例，女性14例，年齡55～76歲，平均(66±7)歲。采用無菌膝關(guān)節(jié)腔穿刺術(shù)，抽取關(guān)節(jié)液。1 500 r/min離心10分鐘，－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 DAB顯色試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。皂素由BIO BASIC INC提供。鼠抗人DcR3 IgG單克隆抗體購自Santa Crutz公司。兔抗鼠二抗購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司。DcR3 ELISA試劑盒購自博士德生物工程有限公司。

1.3 DcR3的檢測(cè) 采用一步法免疫組織化學(xué)法檢測(cè)滑膜組織中DcR3的表達(dá)。簡(jiǎn)要檢測(cè)步驟為:①滑膜標(biāo)本行冰凍切片，厚為5 μm，經(jīng)丙酮(50%)+異丙醇(50%)(4℃預(yù)冷)固定15～30分鐘;②加人0.2%皂素室溫放置30～45分鐘;③2%H2O2室溫作用15分鐘去除內(nèi)源性過氧化物酶;④加入試劑盒中特異性多聚酶標(biāo)記的鼠抗人單克隆一抗4℃過夜。以上各步驟之間均使用含0.02%吐溫20的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌至少3次，每次5分鐘;⑤加入二氨基聯(lián)苯胺(DAB)應(yīng)用液作用5～20分鐘，顯微鏡下終止顯色，蘇木素復(fù)染。封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照:分別PBS代替一抗，其余步驟不變。

1.4 染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在免疫組織化學(xué)染色的滑膜和軟骨組織，凡胞質(zhì)中出現(xiàn)明顯的棕黃色至黃粉色顆粒者為DcR3陽性細(xì)胞。并根據(jù)細(xì)胞形態(tài)，鑒別滑膜組織中的細(xì)胞類型，包括滑膜襯里層細(xì)胞(SLC)、滑膜下層巨噬細(xì)胞樣細(xì)胞(MC)、成纖維樣細(xì)胞(FB)、血管內(nèi)皮細(xì)胞(VE)和單個(gè)核白細(xì)胞(MNC)。每張組織切片在400倍視野下根據(jù)隨機(jī)計(jì)數(shù)原則確定顯微鏡的X軸和Y軸，隨機(jī)采集5個(gè)視野圖像，計(jì)算平均陽性細(xì)胞數(shù)分為5類:0:陽性細(xì)胞＜1%;1:陽性細(xì)胞占1% ～20%;2:陽性細(xì)胞占21% ～40%;3:陽性細(xì)胞占41% ～60%;4:陽性細(xì)胞＞60%。根據(jù)染色程度，將陽性信號(hào)分為4類:0分:沒有著色;1分:染色強(qiáng)度弱;3分:黃至棕黃色染色;2分:染色強(qiáng)度介于弱陽性與強(qiáng)陽性之間。將染色強(qiáng)度記分×陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分，為每例組織染色的最后綜合記分。綜合記分≥1為表達(dá)陽性，＜1則為陰性。記錄每個(gè)圖像所有類型細(xì)胞的總數(shù)、陽性細(xì)胞數(shù)和陽性細(xì)胞類型，計(jì)算平均值。

1.5 ELISA檢測(cè)關(guān)節(jié)液中DcR3的表達(dá) 按照試劑盒說明書進(jìn)行配液，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白及10倍稀釋的關(guān)節(jié)液樣本加入微孔板，加生物素-結(jié)合物(Biotinconjugate)孵育，洗板，加抗生物素蛋白鏈菌素-辣根過氧化物(streptavidin-HRP)孵育，再洗板，加四甲基聯(lián)苯胺(TMB)避光反應(yīng)，加終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450 nm處測(cè)量吸光值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求出各關(guān)節(jié)液樣本中DcR3的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 免疫組化結(jié)果采用兩樣本構(gòu)成比(率)比較的χ2檢驗(yàn)。ELISA結(jié)果采用t檢驗(yàn)。應(yīng)用SPSS10.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 DcR3在滑膜組織免疫組織化學(xué)染色結(jié)果RA、OA和正常滑膜組織DcR3的檢測(cè)結(jié)果見表1和圖1。圖1為RA組、OA組及正常對(duì)照組滑膜組織DcR3表達(dá)的免疫組化圖片。由表1可見，RA滑膜組織細(xì)胞中DcR3陽性細(xì)胞約為72%，主要分布于滑膜組織中滑膜襯里層細(xì)胞(SLC)、血管翳周圍的血管內(nèi)皮細(xì)胞(VE)和單個(gè)核白細(xì)胞(MNC)等;而OA組織中DcR3陽性細(xì)胞數(shù)量較RA明顯減少。主要表達(dá)于滑膜襯里層細(xì)胞(SLC)和單個(gè)核白細(xì)胞(MNC)等，且陽性強(qiáng)度也較RA明顯減弱;而正?；そM織中少見DcR3陽性表達(dá)的細(xì)胞。

2.2 滑膜組織中DcR3的表達(dá)與滑膜組織炎性病變程度的相關(guān)性研究 由圖2可見DcR3的表達(dá)與滑膜組織的炎性程度成正相關(guān)關(guān)系(r=0.803，P＜0.01)。

2.3 RA與OA患者關(guān)節(jié)液中DcR3的表達(dá)量比較結(jié)果 由表2可見，RA及OA患者關(guān)節(jié)液中均可檢測(cè)到DcR3的表達(dá)，但RA組表達(dá)量明顯較高，與OA組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 滑膜組織免疫組化圖片F(xiàn)ig.1 Immunohis tochemistry picture

表1 RA，OA和正?；そM織DcR3表達(dá)量比較Tab.1 The expression of DcR3 in synovial tissue of RA，OA and control groups

表2 RA與OA患者關(guān)節(jié)液中DcR3的表達(dá)量比較Tab.2 The expression of DcR3 in the synovia of RA and OA patients

3 討論

誘騙受體3(DcR3，又稱TR6)是1998年由Pitti等［2］發(fā)現(xiàn)的一種可溶性腫瘤壞死因子受體超家族成員，屬于分泌性蛋白。其特點(diǎn)在于DcR3雖然可與腫瘤壞死因子Fas、HVEM、DR3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合其相應(yīng)配體FasL、LIGHT及TLIA，但由于缺乏胞內(nèi)區(qū)或者由于胞內(nèi)死亡區(qū)不完整，而不能傳導(dǎo)凋亡信號(hào)，具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、死亡以及免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用，與多種疾病等密切相關(guān)。DcR3基因在人胚胎肺、腦、肝和成人脾、胃、結(jié)腸、肺、淋巴結(jié)、脊髓中存在低表達(dá)，但在人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和SW1116中高表達(dá)。在人類惡性腫瘤如胃腸道腫瘤、肺癌、病毒相關(guān)淋巴瘤、原發(fā)性肝癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等及某些自身免疫疾病如進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和矽肺患者的外周血單核細(xì)胞也能檢測(cè)到DcR3的高表達(dá)［4-11］。

圖2 DcR3與滑膜組織炎癥程度的相關(guān)性Fig.2 The correlation of the DcR3 expression and inflammatory lesion in the synovium

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種常見的炎性關(guān)節(jié)病，雖然其主要靶器官是滑膜組織。大量研究顯示在RA的發(fā)病過程中關(guān)節(jié)局部的小分子炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、趨化因子、粘附分子、基質(zhì)金屬蛋白酶等吸引并活化來自外周血的炎癥細(xì)胞，觸發(fā)滑膜細(xì)胞的增殖和活化。病變隨后表現(xiàn)出局部腫瘤的生物學(xué)行為，侵襲并損壞關(guān)節(jié)軟骨、軟骨下骨、肌腱和韌帶?；ぜ?xì)胞周期失調(diào)及凋亡異?？蓪?dǎo)致關(guān)節(jié)滑膜組織過度增生、肥厚從而促進(jìn)RA的發(fā)生［12］。DcR3可以在腫瘤細(xì)胞和惡性腫瘤組織中高表達(dá)，通過其抑制凋亡的作用參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。而病變的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞在局部也表現(xiàn)了腫瘤的生物學(xué)行為，研究發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞同樣存在凋亡不足的現(xiàn)象。Hayashi等［13］用ELISA的方法研究了OA和RA患者血清及關(guān)節(jié)液中DcR3的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RA患者血清及關(guān)節(jié)液中DcR3的濃度較OA組明顯升高，且與TNFα的表達(dá)呈正相關(guān)，但與RA患者的病情活動(dòng)無明顯的相關(guān)性。Hayashi等［14］還用 RT-PCR和 Western blot的方法研究了RA及OA滑膜細(xì)胞中DcR3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OA及RA患者的滑膜細(xì)胞中均表達(dá)DcR3，其表達(dá)量在兩者沒有明顯的差異。作者進(jìn)一步將DcR3融合蛋白與滑膜細(xì)胞共孵育并將DcR3 siRNA轉(zhuǎn)染至滑膜細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)將DcR3融合蛋白抑制了RA滑膜細(xì)胞Fas誘導(dǎo)的凋亡作用，但用siRNA沉默DcR3的表達(dá)后這種抑制作用明顯減弱，而OA滑膜細(xì)胞沒有該表現(xiàn)。我們前期的實(shí)驗(yàn)也已經(jīng)通過ELISA的方法和熒光實(shí)時(shí)定量PCR的方法研究了RA患者DcR3在血清水平和基因水平與健康人群之間的差異［15］。研究發(fā)現(xiàn)DcR3在RA患者血清中表達(dá)的平均水平較健康對(duì)照組明顯升高，但RA組各樣本之間的差異較大，結(jié)合患者的DAS28評(píng)分比較顯示，血清DcR3的表達(dá)水平可能與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)有一定的相關(guān)性。而熒光實(shí)時(shí)定量PCR也發(fā)現(xiàn)在基因水平，RA組外周血單核細(xì)胞DcR3的表達(dá)水平較健康對(duì)照組明顯升高，但與RA病情活動(dòng)沒有明顯關(guān)系。

那么RA患者滑膜組織中是否能夠檢測(cè)到DcR3的表達(dá)呢?其表達(dá)特點(diǎn)是否也與血清中的表達(dá)特點(diǎn)一樣與患者的病情活動(dòng)度相關(guān)呢?在本文中，我們進(jìn)一步運(yùn)用免疫組織化學(xué)的方法研究了RA患者滑膜組織中DcR3的表達(dá)，并與OA患者及正?；そM織對(duì)照。研究發(fā)現(xiàn)RA患者滑膜組織中DcR3的表達(dá)量明顯增高，并且與滑膜組織的炎性程度成正相關(guān)。同時(shí)我們運(yùn)用ELISA的方法檢測(cè)了關(guān)節(jié)液中DcR3蛋白的表達(dá)，也發(fā)現(xiàn)RA患者關(guān)節(jié)液中DcR3的表達(dá)量同樣高于OA患者。以上提示我們RA患者滑膜組織DcR3的過度表達(dá)可能與RA滑膜炎的發(fā)病有一定的關(guān)系。但其是通過哪種通道來實(shí)現(xiàn)的，還有待于進(jìn)一步研究。

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