朱詩白，丁文超，劉瑞敏 ，孫伊儻，劉明鎖，唐一鳴，李 濤，姬新穎，馬遠方，白慧玲

（河南大學(xué) 免疫學(xué)研究所，細胞與分子免疫學(xué)重點實驗室，河南 開封475004）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是隨著人的年齡增長而出現(xiàn)的血管免疫性炎癥疾?。?］。與此關(guān)聯(lián)的冠心病在國內(nèi)平均患病率為6.49%，據(jù)此我國有2 000萬冠心病患者，對家庭和國家造成非常巨大的經(jīng)濟負擔(dān)。冠狀動脈近側(cè)段之所以好發(fā)動脈粥樣硬化是由于它比所有器官的動脈都靠近心室，因而承受最大的收縮壓撞擊。這些部位的血流動力學(xué)比較特殊，很可能影響局部血管內(nèi)皮細胞的基因表達。因此加強血液動力學(xué)特點和內(nèi)皮細胞的基因表達關(guān)系的研究，對冠心病的防治具有十分重要的意義［2］。為探討動脈粥樣硬化發(fā)生的分子機制，我們總結(jié)了50種與動脈硬化的發(fā)生密切有關(guān)基因，見表2。我們初步檢測了人冠狀動脈內(nèi)皮細胞與人主動脈內(nèi)皮細胞的多種基因的表達，比較其表達差異，檢測結(jié)果中發(fā)現(xiàn)有4種基因在人冠狀動脈內(nèi)皮細胞與主動脈內(nèi)皮細胞表達明顯差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人冠狀動脈內(nèi)皮細胞株HCAEC及人主動脈內(nèi)皮細胞株HAEC（美國ScienCell）及內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基ECM（美國ScienCell），購至上海復(fù)蒙生物科技有限公司；實時定量PCR儀RG 6000型（澳大利亞Corbett公司），TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Promega公司），Sybr green PCR試劑盒（北京康為世紀公司），引物合成（北京金唯智公司）。紫外分光光度儀（Beckman公司）。

1.2 方法

1.2.1 人冠狀動脈內(nèi)皮細胞及人主動脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 復(fù)蘇HCAEC及 HAEC，調(diào)節(jié)細胞密度3×106／mL，用含體積分數(shù)為10%胎牛血清 RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco公司）培養(yǎng)，接種于24孔培養(yǎng)板，24h后換用低血清內(nèi)皮細胞培養(yǎng)基ECM培養(yǎng)液24h，換液后即可用于實驗。倒置顯微鏡下細胞呈單層鵝卵石狀生長，臺盼藍染色細胞活力大于97%。

1.2.2 總RNA提取和cDNA的獲取 使用TRIzol提取人冠狀動脈內(nèi)皮細胞及主動脈內(nèi)皮細胞總RNA（具體按試劑說明操作），以DEPC水溶解。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作將獲得的mRNA轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.3 半定量RT-PCR檢測基因的表達量 將獲得的HCAEC及HAEC cDNA稀釋至100ng／μl，以β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)體系和條件按試劑盒說明書進行。用于4種基因RT-PCR的引物序列，見表1。反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)產(chǎn)物10μL進行10g／L瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，在UV-254紫外透射反射分析儀上觀察結(jié)果，并用數(shù)碼凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果并攝像，照片進行圖像分析。

表1 用于基因RT-PCR的引物序列

2 結(jié)果

2.1 5種基因在人主動脈和冠狀動脈內(nèi)皮細胞的表達

RT-PCR結(jié)果顯示可見 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2的mRNA擴增產(chǎn)物片段分別位于相當(dāng)與 Mr200bp、260bp、200bp、200bp、100bp的位置，與預(yù)期理論值大小一致（圖1），產(chǎn)物特異，條帶清晰。

2.2 5種基因在人主動脈和冠狀動脈內(nèi)皮細胞的表達差異

根據(jù)我們的前期研究工作基礎(chǔ)，以及文獻檢索結(jié)果，我們初步判斷出50種與動脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)的基因（表2），有待進一步的實驗驗證，而我們檢測的4種基因（VEGF、COX-2、ENOS、ZO-1）正是表中總結(jié)的抗動脈粥樣硬化基因（＋表示），4種基因的表達特點是在人主動脈內(nèi)皮細胞的mRNA表達水平均高于人冠狀動脈內(nèi)皮細胞，而ICAM2是表2中顯示動脈粥樣硬化基因，特點是在冠狀動脈內(nèi)皮細胞的表達高于主動脈內(nèi)皮細胞（圖1）。

圖1 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1、ICAM2在人主動脈和冠狀動脈內(nèi)皮細胞的表達注：A-HAEC；B-HAC；1-VEGF；2-COX-2；3-eNOS；4-ZO-1；5-ICAM2

表2 我們研究的50種基因在AS中的作用，檢索分析結(jié)果

3 討論

動脈粥樣硬化是一種炎癥性疾病。在粥樣斑塊中存在許多免疫細胞，而且在不穩(wěn)定斑塊中尤為豐富。近年來對動脈粥樣硬化中免疫細胞的聚集、分化和激活有了更深入的了解［3］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了多種與其相關(guān)的病毒和細菌感染。通過研究初步確定了幾個自身性抗原，并提出了自身免疫假說。根據(jù)這些新的認識，提出了免疫調(diào)節(jié)和預(yù)防接種等心血管疾病的新的預(yù)防和治療策略［4］。這必將極大地提高對動脈粥樣硬化的研究和防治水平。在動脈粥樣硬化發(fā)生機制中，免疫學(xué)說越來越引起人們的重視。研究［5－6］發(fā)現(xiàn)免疫細胞在粥樣硬化斑塊中聚集，說明免疫在動脈粥樣硬化發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中也起作用。加強動脈粥樣硬化免疫機制的研究，確定動脈粥樣硬化的免疫學(xué)性質(zhì)，尤其探索天然免疫在動脈粥樣硬化發(fā)生早期的作用，有助于徹底闡明動脈粥樣硬化的發(fā)生機制。

動脈粥樣硬化最早的改變?yōu)檠軆?nèi)皮細胞功能異常［7］。作用于血管內(nèi)皮細胞的力有2種：流體對管壁的剪應(yīng)力（wall shear stress，WSS）和固體周圍牽張力（circumferential strain，CS），前者是由血流驅(qū)動的，血管長軸平行；而后者則是由血壓驅(qū)動引起的，是垂直于血管壁的環(huán)形張力，作用于血管壁所有細胞。這2種力同時作用于襯于血管的內(nèi)皮細胞，從而可以調(diào)節(jié)其表型。在動脈粥樣硬化最顯著的循環(huán)部位如冠狀動脈，CS和 WSS是非常不同步的［8］。故認為血液動力學(xué)特點與冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生密切相關(guān)［9］。相對于冠狀動脈，主動脈為不易發(fā)生粥樣硬化的部位，為了探討主動脈和冠狀動脈的血液動力學(xué)特點對粥樣硬化形成的影響，我們選擇檢測5種與免疫學(xué)相關(guān)的基因并比較在主動脈和冠狀動脈內(nèi)皮細胞的表達，四種基因 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1均為我們在初步研究結(jié)果的基礎(chǔ)上經(jīng)過檢索確定的可能為抗動脈粥樣硬化的基因，而我們的檢測結(jié)果也證實了我們的推測，主動脈內(nèi)皮細胞較冠狀動脈更易表達 VEGF、COX-2、eNOS、ZO-1。而ICAM2為動脈粥樣硬化基因，冠狀動脈內(nèi)皮細胞較主動脈內(nèi)皮細胞高表達ICAM2，可能使其易發(fā)動脈粥樣硬化。

表2中基因的作用是根據(jù)文獻檢索結(jié)果，我們課題組初步確定的，共有“動脈粥樣硬化易感基因”21種（－表示），“動脈粥樣硬化保護基因”27種（＋表示），另有兩種基因APOA與APOB作用尚無確定。我們檢測只是我們的初步驗證，根據(jù)我們的前期研究，我們推測在不同的動脈內(nèi)皮細胞內(nèi)有不同的特異基因的表達，在冠狀動脈等動脈粥樣硬化好發(fā)部位，由于血液動力學(xué)特點WSS和CS不同步性高，使得兩類基因的表達失衡，基因表達呈現(xiàn)動脈粥樣硬化性特點；而在主動脈等動脈粥樣硬化非好發(fā)部位，WSS和CS同步性較好，其基因表達呈現(xiàn)抗動脈粥樣硬化性特點。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果及文獻檢索結(jié)果［10］我們認為正常情況下，動脈保護性基因與動脈粥樣硬化性基因處于平衡狀態(tài)，而在動脈粥樣硬化易發(fā)區(qū)，平衡易被打破，造成動脈粥樣硬化和冠心病，該假設(shè)我們將進一步通過體內(nèi)、體外實驗進一步證實并修改。

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［10］姬新穎、李濤、劉瑞敏，等.血流動力學(xué)新特點與冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)系［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2011，30（4），231－237.