武曉紅，肖 嫻，趙 輝

（河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開封475004）

利巴韋林又名三氮唑核苷（Ribavirin），主要用于①幼兒呼吸道合胞病毒肺炎。②甲型、乙型流感和副流感病毒感染。③流行性出血熱。④單純皰疹。⑤麻疹、腮腺炎、水痘、帶狀皰疹等。利巴韋林滴眼液，適用于單純皰疹病毒性角膜炎。諾氟沙星，氟喹諾酮類抗菌藥，具廣譜抗菌作用，尤其對需氧革蘭氏陰性桿菌的抗菌活性高。

諾氟沙星為殺菌劑，通過作用于細菌DNA螺旋酶的A亞單位，抑制DNA的合成和復(fù)制而導(dǎo)致細菌死亡。諾氟沙星滴眼液主要用于敏感致病菌引起的眼部感染如結(jié)膜炎，角膜炎，沙眼，淚囊炎及眼瞼炎。

紅眼靈滴眼液是河南省人民醫(yī)院眼科研究所研制的一種滴眼液，用于治療“紅眼病”和腺病毒角結(jié)膜炎，有較好的療效，彌補了眼科制劑的不足，為解決患者的病痛提供了更為方便的選擇，該制劑在該院臨床廣泛使用。其處方組成為：利巴韋林（1%），諾氟沙星（0.3%），氯化鈉（0.5%），羥苯乙脂（0.04%）。

文獻［1－2］曾報道用差示紫外分光光度法和高效液相色譜法測定諾氟沙星含量，用紫外分光光度法［3］和高效液相色譜法［4］測定利巴韋林含量。但是文獻當(dāng)中基本沒有對本復(fù)合制劑的含量檢測方法，而我們建立了HPLC法同時測定紅眼靈滴眼液中利巴韋林和諾氟沙星含量，該法簡便、準確 ，可為制定紅眼靈滴眼液質(zhì)量標(biāo)準及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與與方法

1.1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀；自動進樣器；DAD檢測器；Agilent Chemsstation色譜工作站；甲醇為色譜純；磷酸為分析純。利巴韋林和諾氟沙星對照品由中國藥品生物制品檢定所提供，紅眼靈滴眼液（規(guī)格：8mL：利巴韋林80mg與諾氟沙星24mg）由河南省眼科研究所制劑室制備。

1.2 色譜條件

色譜柱：Diamonsil（鉆石）C18柱（250mm×4.6mm，5μm），0.025mol／L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH 至3.0±0.1）-乙腈（85∶15），流速：1.0mL／min，檢測波長：207nm，進樣量：20μL。結(jié)果：利巴韋林與諾氟沙星的保留時間分別為2.70min，10.80min，理論塔板數(shù)分別為3 770，5 360，分離度大于1.5，符合 測試要求。空白樣品溶液試驗表明：處方中輔料對測定無干擾。色譜圖見圖1。

圖1 對照品（A）、陰性樣品（B）、樣品色譜圖（C）1.利巴韋林2.諾氟沙星3.溶劑

1.3 線性范圍

精密稱取經(jīng)105℃干燥至恒重的對照品利巴韋林80mg、諾氟沙星24mg，置100mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為儲備液。精密吸取此溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL分別置25mL量瓶中，超純水稀釋至刻度，搖勻。取標(biāo)準系列溶液各20μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度（g／mL）為橫坐標(biāo)，繪制利巴韋林和諾氟沙星標(biāo)準曲線?；貧w方程、相關(guān)系數(shù)（n＝6）分別為：① 利巴韋林：A ＝56.89C＋1.230，r＝0.9998。②諾氟沙星：A＝58.32C＋2.635，r＝0.9997。

結(jié)果表明，利巴韋林在10.0～100.0μg／mL和諾氟沙星在3.0～30.0μg／mL濃度范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

1.4 方法專屬性考察

取樣品各5mL，經(jīng)以下條件處理：①置100℃放置12h；②在光強度為（4000±300）μ條件下放置12h；③加1mol／L氫氧化鈉溶液1mL于100℃放置12h；④加1mol／L鹽酸溶液1mL于100℃放置12h；⑤加l%過氧化氫溶液1mL于80℃放置12h。然后對破壞樣品進行中和，照樣品含量測定項下稀釋、濾過，分別取濾液20μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖2。結(jié)果表明：樣品處理后較處理前有新的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，雜質(zhì)含量升高，各雜質(zhì)峰與主要峰分離良好（R＞1.5）。

1.5 最低檢測限

取線性范圍測定項下的對照品溶液逐級稀釋并進樣，按信噪比為3倍計，作為檢測限。經(jīng)測定，本色譜系統(tǒng)條件下利巴韋林和諾氟沙星的最低檢測限分別為5ng和4ng。

1.6 精密度試驗

1.6.1 精密度 同一樣品溶液重復(fù)進樣6次，記錄利巴韋林和諾氟沙星色譜峰峰面積，求得利巴韋林和諾氟沙星的RSD分別為0.10%和0.13%（n＝6）。1.6.2 重復(fù)性 取紅眼靈滴眼液樣品，重復(fù)取樣6次，記錄利巴韋林和諾氟沙星色譜峰峰面積，求得利巴韋林和諾氟沙星的RSD 分別為0.57%和0.63%（n＝6）。

1.7 穩(wěn)定性試驗

取精密度試驗項下的溶液，室溫放置，保持色譜系統(tǒng)穩(wěn)定，于0、1、2、4、8、12h測定，利巴韋林和諾氟沙星的RSD分別為1.5%和0.67%，說明樣品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖2 HPLC方法專屬性考察圖譜A.樣品加熱破壞B.樣品光照被破壞C.堿破壞樣品D.酸破壞樣品E.氧化破壞樣品

1.8 回收率試驗

按處方比例分別精密稱取利巴韋林和諾氟沙星對照品，并加入適量輔料配制成含利巴韋林和諾氟沙星80.0%～120.0%的模擬樣品9份，按“樣品含量測定”項方法進行測定，計算回收率及RSD，結(jié)果利巴韋林和諾氟沙星平均回收率（n＝9）分別為99.5%和99.7% ，RSD分別為0.70%和0.56%。

1.9 樣品含量測定

精密量取樣品5mL，置100mL量瓶中，加超純水定容。精密量取上述稀釋液5mL，置50mL量瓶中，加超純水定容，進樣20μL，在上述色譜條件下測定；同時另取利巴韋林和諾氟沙星對照品適量，用超純水稀釋成每1mL含利巴韋林50μg和諾氟沙星15μg的溶液作為對照品溶液，同法測定；記錄色譜峰面積，以外標(biāo)法計算含量，結(jié)果見表1。

表1 樣品測定結(jié)果（標(biāo)示量%，n＝3）

2 討論

雖然選擇文獻中流動相0.025mol／L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH至3.0±0.1）-乙腈（87∶13）利巴韋林與諾氟沙星能達到較好的分離，但諾氟沙星峰有明顯拖尾，并且保留時間相對較晚，而將0.025mol／L磷酸溶液（用三乙胺調(diào)pH至3.0±0.1）-乙腈比例改為85∶15，雖改為87∶13后諾氟沙星保留時間大大提前但是相對受乙腈的影響也越大故最后選擇85∶15，此比例下的流動相有效地改變了諾氟沙星的色譜行為，保留時間明顯縮短，柱效明顯提高。

由于諾氟沙星在水中微溶，在酸中極易溶解，所以在配制對照品溶液時先加入1.0mol／L鹽酸溶液2mL使諾氟沙星溶解后，再用超純水進行稀釋。

［1］姜玲.差示紫外分光光度發(fā)測定諾氟沙星滴眼液的含量［J］.安徽醫(yī)藥，2004，9（2）：112.

［2］王中蘭，陳菊，馮碧敏.HPLC測定諾氟沙星滴眼液的含量［J］.哈爾濱醫(yī)藥，2006，26（1）：102.

［3］唐志立，彭賢東，陳建勛等.紫外分光光度法測定利巴韋林注射液的含量［J］.四川醫(yī)學(xué)，2001，12（12）：3－4.

［4］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）［S］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：260.

［5］敬永生，胡海廷，徐曉燕.高效液相色譜法測定鹽酸川芎注射液的含量［J］.河南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2009，28（1）：47－48.