賈 晶 王振生 高宇輝 劉 娟 王 恒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100005)

瘧疾是世界上最嚴(yán)重的寄生原蟲(chóng)感染性疾病之一，一直以來(lái)都威脅著人類(lèi)健康(WHO，2012)。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，瘧原蟲(chóng)的相關(guān)研究也日益深入，瘧原蟲(chóng)基因及其編碼蛋白功能的揭示為瘧疾防治提供了新思路。由于鼠瘧原蟲(chóng)基因改造技術(shù)的廣泛推廣及其完整生命周期分析的可實(shí)現(xiàn)性(Janseetal.，2011)，使得鼠瘧原蟲(chóng)成為研究人類(lèi)瘧原蟲(chóng)使用最頻繁的模式生物。近年來(lái)反向遺傳學(xué)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于研究瘧原蟲(chóng)基因功能及其與宿主間相互作用的分子機(jī)制(Carvalhoetal.，2005；Bauletal.，2007)。基因的靶向破壞成為深入研究瘧原蟲(chóng)基因定位及其表達(dá)蛋白的功能的重要手段。而這些研究均以轉(zhuǎn)染作為基礎(chǔ)的應(yīng)用技術(shù)之一。為保證轉(zhuǎn)染的高效性，通常采用體外培養(yǎng)的方法可以使瘧原蟲(chóng)發(fā)育至成熟裂殖體期后停止生長(zhǎng)(Janseetal.，2006),從而獲得大量成熟裂殖體，將其及發(fā)育完全的裂殖子作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對(duì)象。但是傳統(tǒng)方法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)20～22 h(陳俊等，2006)，期間對(duì)于培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻，難以保持穩(wěn)定。本文就伯氏瘧原蟲(chóng)PbANKA1596cl1體外培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步提高鼠瘧轉(zhuǎn)染效率奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

伯氏瘧原蟲(chóng)PlasmodiumbergheiANKA(PbANKA1596cl1，后文用Pb1596代替)由荷蘭萊頓大學(xué)(Leiden University Medical Center，LUMC)Shahid Khan教授的瘧疾研究課題組惠贈(zèng)，為新型轉(zhuǎn)染體系GIMO(Linetal.，2011)模式生物；6～8周齡的ICR小鼠(雌性，18～20 g,北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司)、RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院細(xì)胞中心)、Nycodenz (Sigma)、各種型號(hào)離心管(BD公司)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(Corning, USA)、恒溫培養(yǎng)箱(北京國(guó)光醫(yī)化儀器廠)、顯微鏡(Olympus CH，Japan)、水平離心機(jī)(Eppendorf，Germany)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蟲(chóng)株復(fù)蘇：液氮中保存良好的伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596，迅速置于37 ℃水浴，融化后移入15 mL離心管，逐滴加入0.2倍體積的12% NaCl與 9倍體積的1.6% NaCl洗滌細(xì)胞，2 000 r/min，3 min,棄上清；再用9倍體積的0.9% NaCl+0.2%葡萄糖洗滌細(xì)胞，2 000 r/min，3 min，棄上清；0.9% NaCl+0.2%葡萄糖溶液按照所用體積重懸下層細(xì)胞沉淀后，100 μL/只尾靜脈注射入健康ICR小鼠體內(nèi)。

1.2.2傳代培養(yǎng)：經(jīng)尾靜脈接種的ICR小鼠，待原蟲(chóng)率達(dá)5%～15%，尾靜脈取血2～4滴于400 μL枸櫞酸鈉PBS中, 混勻后以200 μL/只腹腔接種健康ICR小鼠2只 。

1.2.3原蟲(chóng)率計(jì)算：腹腔接種感染后每天固定時(shí)間小鼠尾部采血，血細(xì)胞涂片，甲醇固定，姬姆薩原液與水1∶6配制染液染色15 min后100×油鏡觀察。原蟲(chóng)率=感染紅細(xì)胞數(shù)/所計(jì)數(shù)區(qū)域內(nèi)全部紅細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4Pb1596體外培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)中為比較優(yōu)化前后方法效果的不同，采用兩種方法體外培養(yǎng)Pb1596，傳統(tǒng)方法完全按照文獻(xiàn)(Janseetal.，2006)操作；優(yōu)化后的方法為：腹腔接種的小鼠4～5 d后，原蟲(chóng)率達(dá)5%～15%，且大部分原蟲(chóng)處于滋養(yǎng)體期。心臟穿刺取血用10倍體積的枸櫞酸鈉PBS混勻后1 600 r/min離心8 min，棄上清；細(xì)胞沉淀用10倍體積的完全培養(yǎng)基重懸后1 600 r/min離心8 min，棄上清；用7倍體積的完全培養(yǎng)基再次重懸細(xì)胞沉淀，并緩慢加入事先添加3 mL 55% Nycodenz工作液(55 mL Nycodenz 儲(chǔ)存液/45 mL RPMI-1640)的離心管，1 600 r/min離心20 min。所需滋養(yǎng)體期感染紅細(xì)胞位于中間層面，將其小心吸入50 mL離心管中，加入10倍體積的完全培養(yǎng)基，混勻后1 600 r/min離心8 min，棄上清； 1 mL完全培養(yǎng)基重懸沉淀，注入事先加入9 mL完全培養(yǎng)基的 25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并在瓶中注入體積比為 5∶3∶92的CO2、O2和N2的混合氣體30～60 s，迅速擰緊瓶口，37 ℃，40 r/min(細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)即可)低速振蕩培養(yǎng)8～10 h。每種方法均使用購(gòu)于同一公司的6～8周齡ICR小鼠1只，培養(yǎng)蟲(chóng)血體積均處于0.6～0.7 mL。

1.2.5細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)觀察：體外培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后(傳統(tǒng)方法：20～22 h，優(yōu)化后：8～10 h)，取500 μL培養(yǎng)液，12 000 r/min急速離心10 s，棄上清，沉淀染色15 min，100×油鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.6同一生長(zhǎng)周期內(nèi)不同發(fā)育階段瘧原蟲(chóng)形態(tài)觀察：在瘧原蟲(chóng)一個(gè)生長(zhǎng)周期內(nèi)每隔2 h小鼠尾部采血顯微鏡觀察計(jì)數(shù)不同發(fā)育階段蟲(chóng)株所占比例。成熟裂殖體(%)=成熟裂殖體感染紅細(xì)胞數(shù)/全部感染紅細(xì)胞總數(shù)；滋養(yǎng)體(%)=滋養(yǎng)體感染紅細(xì)胞數(shù)/全部感染紅細(xì)胞總數(shù)。

1.2.7細(xì)胞存活率計(jì)算：細(xì)胞懸浮液適當(dāng)倍數(shù)稀釋?zhuān)凑?00∶1的比例臺(tái)盼藍(lán)染色，靜置 1 min后活細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞存活率(%)=活細(xì)胞總數(shù)/總細(xì)胞數(shù)。

1.2.8數(shù)據(jù)分析：SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，表1結(jié)果采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596生長(zhǎng)趨勢(shì)

觀察正常情況下小鼠體內(nèi)伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596生長(zhǎng)狀態(tài)，繪制生長(zhǎng)曲線如圖1。正常情況下Pb1596感染的小鼠可存活1周，感染當(dāng)天記為d0，第2 d記為d1，依次類(lèi)推。感染后小鼠原蟲(chóng)率呈遞增趨勢(shì)，d3時(shí)達(dá)1%～3%，此時(shí)為傳統(tǒng)體外培養(yǎng)方法采血最佳區(qū)間(Janseetal.，2006)；d4～d5升至5%～15%，此時(shí)小鼠及瘧原蟲(chóng)狀態(tài)良好，瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)處于對(duì)數(shù)期，是小鼠感染傳代最佳區(qū)間，因此為保證體外短期培養(yǎng)細(xì)胞高存活率，并增大裂殖體比例，達(dá)到良好的培養(yǎng)效果，本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)化方法的采血時(shí)間定為此區(qū)間。

圖1 伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of the Pb1596

圖2 伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596同一生長(zhǎng)周期內(nèi)發(fā)育特征Fig.2 Characteristics of Pb1596 in one growth cycle左側(cè)Y軸：同一生長(zhǎng)周期內(nèi)不同期瘧原蟲(chóng)感染紅細(xì)胞所含百分比；右側(cè)Y軸：同一生長(zhǎng)周期內(nèi)原蟲(chóng)率變化。Left Y-axis: the proportion of RBC infected by parasites at the different stage; Right Y-axis: the parasitemia in one growth cycle.

2.2 伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596同一生長(zhǎng)周期內(nèi)發(fā)育特征

在保證小鼠正常生長(zhǎng)狀態(tài)下，體內(nèi)伯氏瘧原蟲(chóng)的生長(zhǎng)周期為22～24 h(Janseetal.，2006)。同一生長(zhǎng)周期內(nèi)蟲(chóng)株發(fā)育特征如圖2所示，同一周期內(nèi)，成熟裂殖體感染紅細(xì)胞所占比例處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，且均小于2.5%，不足以達(dá)到轉(zhuǎn)染所需水平，相同時(shí)間點(diǎn)，滋養(yǎng)體感染紅細(xì)胞比例達(dá)30%～55%，其比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于同期裂殖體，將其富集后體外培養(yǎng)可以成為提高成熟裂殖體比

例的候選方法之一。

2.3 體外培養(yǎng)方法優(yōu)化前后差異

在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上本實(shí)驗(yàn)從采血時(shí)原蟲(chóng)率、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)體積等方面對(duì)伯氏瘧原蟲(chóng)體外培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，如表1。采血原蟲(chóng)率的提高保證了滋養(yǎng)體較高的含量，縮短體外培養(yǎng)時(shí)間避免血細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于體外不穩(wěn)定生長(zhǎng)環(huán)境，包括環(huán)境氣體比例、pH等。因此,本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后在保證細(xì)胞高存活率的同時(shí)縮短實(shí)驗(yàn)周期，使裂殖體保持良好發(fā)育狀態(tài)，提高成熟裂殖體比例并增加單個(gè)裂殖體所含裂殖子數(shù)目，為進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)染效率奠定良好基礎(chǔ)。

2.4 體外培養(yǎng)方法優(yōu)化前后蟲(chóng)株生長(zhǎng)狀態(tài)比較

兩種方法實(shí)驗(yàn)前后蟲(chóng)株生長(zhǎng)狀態(tài)如圖3所示，優(yōu)化后成熟裂殖體比例顯著增加，且有大量游離的發(fā)育完全的裂殖子，可被一同收集，充分利用，且單個(gè)裂殖體所含裂殖子數(shù)目增多，有助于提高轉(zhuǎn)染成功率。

表1 兩種方法培養(yǎng)伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596的差異Tab.1 Differences about the Pb1596 culture conditions between the two methods

注：表中數(shù)據(jù)為3組獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，*表示P<0.05。

Note: Data in the table are the averages of three sets of independent repeated experiments ±SD (*P<0.05).

圖3 優(yōu)化前后伯氏瘧原蟲(chóng)Pb1596生長(zhǎng)狀態(tài)差異Fig.3 Growth status difference of the Pb1596 before and after optimizationA．傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)前紅細(xì)胞及瘧原蟲(chóng)形態(tài)，箭頭所指為感染紅細(xì)胞，此時(shí)原蟲(chóng)率為1.86%；B.傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)前紅細(xì)胞及瘧原蟲(chóng)形態(tài)，箭頭所指也為感染紅細(xì)胞，此時(shí)原蟲(chóng)率為11.22%；C.傳統(tǒng)方法體外培養(yǎng)22 h后瘧原蟲(chóng)形態(tài)，箭頭所指為成熟裂殖體，圈中為游離裂殖子；D.優(yōu)化方法體外培養(yǎng)9 h時(shí)后瘧原蟲(chóng)形態(tài)，箭頭所指為成熟裂殖體，圈中為游離裂殖子.A. Erythrocyte and the parasites before in vitro cultivation using the traditional method, arrow to infect red blood cells, the parasitemia is 1.86%; B. Erythrocyte and the parasites before in vitro cultivation using the improved method, arrow to infect red blood cells, the parasitemia is11.22%;C: Parasites after in vitro cultivation for 22 hours using the traditional method, arrow to mature schizonts and the cycle to the free merozoites; D. Parasites after in vitro cultivation for 9 hours using the improved method, arrow to mature schizonts and the cycle to the free merozoites.

3 討論

轉(zhuǎn)染技術(shù)的推廣加快了反向遺傳學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，為實(shí)現(xiàn)其基因功能的研究帶來(lái)新的曙光。將外源DNA導(dǎo)入寄生于紅細(xì)胞的瘧原蟲(chóng)細(xì)胞核，必須經(jīng)過(guò)紅細(xì)胞膜、納蟲(chóng)空泡膜、瘧原蟲(chóng)細(xì)胞膜和蟲(chóng)體細(xì)胞核膜4層膜，實(shí)際進(jìn)入蟲(chóng)體核內(nèi)的DNA大大減少。而只有當(dāng)瘧原蟲(chóng)處于成熟裂殖體及發(fā)育充分的裂殖子時(shí)才有利于外源DNA的進(jìn)入，所以，成熟裂殖體比例對(duì)于瘧原蟲(chóng)轉(zhuǎn)染效率的影響十分重要。盡管通常采用的體外20～22 h培養(yǎng)方法轉(zhuǎn)染效率已經(jīng)優(yōu)于之前的報(bào)道(van Dijketal.，1995；Menardetal., 1997)，但體外瘧原蟲(chóng)培養(yǎng)環(huán)境中pH值、培養(yǎng)基能量供應(yīng)及氣體含量等條件要求苛刻，在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中不易保持穩(wěn)定，加大了操作難度。針對(duì)上述問(wèn)題，本實(shí)驗(yàn)室對(duì)其體外培養(yǎng)方法進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)采集瘧原蟲(chóng)生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的感染紅細(xì)胞，離心富集滋養(yǎng)體期感染紅細(xì)胞，體外短期培養(yǎng)8～10 h，提高了成熟裂殖體比例，增加單個(gè)裂殖體所含裂殖子數(shù)目，且縮短了實(shí)驗(yàn)周期。此外，傳統(tǒng)方法的操作是在體外培養(yǎng)后梯度離心分離成熟裂殖體，此時(shí)游離裂殖子不能一同被收集，而本實(shí)驗(yàn)中先梯度分離再進(jìn)行體外培養(yǎng)，最終將游離裂殖體一同收集，增加了裂殖子利用率。然而，本實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中出現(xiàn)細(xì)胞存活率小范圍(<1%)下降現(xiàn)象，在今后的實(shí)驗(yàn)中從細(xì)胞與培養(yǎng)基比例，氣體含量等方面仍有待改進(jìn)。