張耀允 黎 浩 龔正達 趙曉光 劉 瑋**

(1. 安徽醫(yī)科大學研究生學院，合肥 230032；2. 軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所，病原微生物學生物安全國家重點實驗室，北京 100071；3. 云南省地方病防治所，云南大理 675600)

巴爾通體Bartonella是一種寄生于脊椎動物紅細胞內(nèi)的革蘭陰性桿菌(Boulouisetal.，2005)。目前，發(fā)現(xiàn)的巴爾通體有24種及亞種，其中至少12種可以引起人類疾病(Hennetal.，2007)，如：貓抓病(Dolanetal.1993)、戰(zhàn)壕熱(Maurinetal.1996)、心內(nèi)膜炎(Drancourtetal.，1996)、桿菌性血管瘤(Koehleretal.，1992)等疾病。云南省位于中國西南部，其地形復雜，存在多種氣候類型，因此小獸類宿主分布廣泛。近年來，有相關(guān)文獻報道了云南地區(qū)健康人群中存在巴爾通體感染(白瑛等，2004)。為進一步研究其傳播途徑和防治方法提供重要依據(jù)，本次研究選取云南西北部高山地區(qū)，對其中小獸類宿主感染巴爾通體的情況進行調(diào)查。

1 材料與方法

1.1 標本采集

2005與2006年10～11月間，在云南西北部怒江傈僳族自治州和迪慶藏族自治州共選取10個采樣地。采樣點分布于海拔1 200～4 300 m之間，包括高寒山區(qū)、高原氣候、亞熱帶季風季候、溫帶季風氣候以及各氣候類型間的過渡區(qū)域，該區(qū)域有豐富的物種多樣性。采用夾夜法捕捉野生小獸，然后無菌操作取脾臟，置于離心管中，液氮內(nèi)保存。

1.2 DNA提取

脾臟DNA提?。喝?0 mg脾臟樣本研磨后，采用TIANamp Genomic DNA Kit 組織基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，按說明書逐步提取DNA。

1.3 聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)

以提取的DNA為模板，采用聚合酶鏈反應(yīng)對熱休克蛋白groEL基因(Inoueetal.，2009)進行擴增以證實是否存在巴通體，所用核苷酸引物： groEL277F：5′-ACTGTTTT(A/G)GGACA(A/G)GCTATTG-3′;GroEL572R：5′-TCAACG ACTTC(C/T)AATTCCGTT-3′，擴增長度294 bp，以BartonellaquintanaRM-11(GenBank: CP003784)為陽性對照。PCR反應(yīng)體系30 μL，DNA模板2 μL， 10×PCR緩沖液3 μL，10 μmol/L引物0.5 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，去離子水22.8 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸30 s，40個循環(huán); 72℃后延伸7min，反應(yīng)在ABI 9700PCR儀上進行。

1.4 電泳

PCR反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物5 μL加入1.5%的瓊脂糖凝膠(含EB)的加樣孔中，用DL2000 DNA Marker 作參照(TaKaRa，大連)，120 V電壓下電泳30 min，取出膠塊，置于凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

為避免污染引起假陽性反應(yīng)，DNA的提取，反應(yīng)液的制備，模板DNA添加，PCR擴增及電泳觀察均在不同的房間進行，反應(yīng)液制備與模板DNA添加所用的移液器分開專用，同時每次實驗都設(shè)立空白(水)對照。

1.5 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗比較不同小獸種間、氣候類型及海拔間感染率差異，P<0.05判定具有統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果

2.1 捕獲動物情況

本次研究共捕獲688只動物，其中以姬鼠屬為優(yōu)勢鼠種共182只，其次為絨鼠屬151只、白腹鼠屬134只、鼩鼱類112只、鼠兔屬39只、大足鼠29只、田鼠屬25只，其他小獸(松鼠、黃鼬等)15只。

2.2 PCR檢測結(jié)果

共檢測出巴爾通體陽性標本72份，陽性率為10.47%。所有陽性結(jié)果經(jīng)測序分析，均為巴通體的相應(yīng)序列(圖1)。

圖1 groEL基因片段的凝膠電泳圖Fig.1 Gel electrophoresis image of amplified groEL partial sequenceM：DL2000; 1：陽性對照; 2～14: 陽性樣本；15：空白對照。M: DL2000; 1: Positive control; 2-14: Positive samples; 15: Blank control.

按不同鼠種類型進行比較發(fā)現(xiàn)，姬鼠屬陽性率最高(46/182， 25.27%)，其樣本次為田鼠屬(2/25，8.00%)，絨鼠屬(9/151，5.96%)，大足鼠(2/29，6.90%)，白腹鼠屬(5/134，3.73%)，鼠兔類(1/39，2.56%)，不同小獸的檢測陽性率之間有顯著性差異(P<0.001)(表1)，證明在本次研究調(diào)查區(qū)域內(nèi)，姬鼠屬比其他小獸類宿主更易攜帶巴爾通體。

表1 云南省小獸類宿主動物中巴爾通體感染情況Tab.1 Prevalence of Bartonella infection in small mammals of Yunnan

卡方檢驗比較不同宿主間陽性率，P<0.001，χ2=64.756.

Indicates statistically significant difference,P<0.001，χ2=64.756 by Chi-square test.

本次研究選取采樣點分屬于不同氣候類型(段旭等，2011)：小中甸千湖山、千湖山、鹿馬登鄉(xiāng)、片馬鎮(zhèn)地區(qū)屬溫帶季風氣候，該地捕獲小獸的陽性率為10.51%(39/371)，各咱紅山與德欽升平鎮(zhèn)地區(qū)屬高寒山區(qū)，捕獲小獸的陽性率為4.94% (4/81)，虎跳峽與福貢上帕鎮(zhèn)屬亞熱帶季風氣候，捕獲小獸的陽性率為13.16% (5/38)，三壩納西族鄉(xiāng)與團結(jié)村地區(qū)屬高原氣候，陽性率為12.12% (24/298)?？ǚ綑z驗發(fā)現(xiàn)，不同氣候類型間陽性率無顯著性差異，P=0.207(表2)。

本次研究采樣點分布于海拔1 200～4 300 m的高原山區(qū)，根據(jù)不同海拔將樣本分成4組(表3)：1 200～2 000、2 000～3 000、3 000～4 000、4 000 m以上。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，不同海拔間陽性率分別為9.05%，13.85%，7.89%和15.07%，卡方檢驗發(fā)現(xiàn)各組間陽性率無顯著性差異，P=0.207。

2.3 序列分析

從本次研究所擴增到的巴爾通體groEL基因中選取4株有代表性的序列與GenBank中12株標準序列，選擇根瘤菌(AY837546)為外群，采用MEGA5.1軟件進行比對，應(yīng)用Neighbor-Joining方法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，選擇bootstrap分析，繪制重復參數(shù)設(shè)置1 000次。進化分析表明，在云南西北部地區(qū)的小獸宿主中的巴爾通體分為兩種基因型Bartonellatribocorum、Bartonellarattimassiliensis。

結(jié)果顯示本次研究中的云南香格里拉小中甸千湖山地區(qū)捕獲的短尾鼩(編號305)、瀘水片馬鎮(zhèn)地區(qū)捕獲的灰頸鼠兔(編號417)為代表的序列與B.rattimassiliensis(AY515128)同源性達97%，屬于同一分支。而在福貢亞坪地區(qū)捕獲的中華姬鼠(編號653)中檢測的巴爾通序列與B.tribocorum(AM260525)同源性最高，達到99%。

表2 云南省不同氣候類型小獸類宿主動物的巴爾通體感染率Tab.2 Infection rate of Bartonella in small mammal animals from different climate types

卡方檢驗比較不同氣候類型間陽性率，P=0.207,χ2=3.287.

Indicates statistically no significant difference ,P=0.207,χ2=3.287 by Chi-square test.

表3 云南省不同海拔捕獲小獸類宿主動物的巴爾通體感染率Tab.3 Infection rate of Bartonella in small mammal animals from different altitude

卡方檢驗比較不同海拔間陽性率，P=0.219,χ2=3.243.

Indicates statistically no significant difference,P=0.219,χ2=3.243 by Chi-square test.

圖2 基于巴爾通體groEL基因部分測序結(jié)果的進化分析Fig.2 Phylogenetic analysis based on partial groEL gene of Bartonella●：本研究所測得序列Sequence used in this study; Bartonella clarridgeiae：克氏巴爾通體；Bartonella rochalimae：羅氏巴爾通體；Bartonella henselae：漢賽巴爾通體；Bartonella quintana：五日熱巴爾通體；Bartonella doshiae：多氏巴爾通體；Bartonella birtlesii：布氏巴爾通體；Bartonella grahamii：格氏巴爾通體；Bartonella taylorii：泰氏巴爾通體。

3 討論

國內(nèi)外研究證實巴爾通體在小獸類宿主中的帶菌率很高，英國地區(qū)62.2%(23/27)(Birtlesetal.，1994)，美國南部42.7%(119/279)(Kosoyetal.，1997)，美國西北部33.3%(37/111)(Jacomoetal.，2002)。在我國云南地區(qū)，幾次對嚙齒類動物巴爾通體自然感染情況的調(diào)查研究中顯示，其平均感染率在14.1%～44.3%(白瑛等，2002; 白瑛等，2003; 栗冬梅等，2004a；栗冬梅等，2004b)。攜帶巴通體的主要宿主動物為貓、犬、牛以及嚙齒類，其中野生嚙齒類的檢出率最高。本次研究中云南西北部地區(qū)小獸類宿主的巴爾通體帶菌率為10.47%，略低于其他文獻報道。

以往文獻中未曾報道云南地區(qū)松鼠屬攜帶巴通體的報道，本研究共捕獲8只松鼠，其中6只隱紋花松鼠Tamiopsswinhoei，2只眀紋花松鼠Tamiopsmacclelland，在怒江傈僳族自治州福貢縣上帕鎮(zhèn)捕獲的隱紋花松鼠中檢測到1只攜帶巴爾通體，為云南地區(qū)松鼠屬可以在自然狀態(tài)下攜帶巴通體提供證據(jù)。

在本次研究中所捕獲的688只小獸中，各種屬中都有巴爾通體檢出，其中姬鼠屬檢出率最高(25.27%)，明顯高于其他鼠種，證明在本次研究采樣地區(qū)，姬鼠屬比其他宿主更容易攜帶巴爾通體。國內(nèi)研究報道，我國云南省存在巴爾通體疫源地，在疫源地內(nèi)的優(yōu)勢鼠種分別為黃胸鼠與齊氏姬鼠，而本次調(diào)查研究捕獲宿主中未見黃胸鼠，分析原因為本次采集地海拔較高，大多為高原山區(qū)，而黃胸鼠主要分布于低海拔地區(qū)。本研究采樣點的選擇按照不同氣候類型和海拔分組，確保采集樣品對不同類型生境的代表性。分析不同海拔和氣候?qū)π～F類宿主的巴爾通體帶菌率，其差別無統(tǒng)計學意義。說明在不同海拔與氣候類型中的小獸類宿主均存在對巴爾通體的攜帶且無選擇差異。

本研究中所檢出的巴爾通主要分為兩種基因型Bartonellatribocorum、B.rattimassiliensis，該兩種基因型的巴爾通體分布在不同的采樣點，在怒江傈僳族自治州檢出的巴爾通體主要為B.tribocorum型而在迪慶藏族自治州檢出的巴爾通體主要為B.rattimassiliensis型，提示在不同地區(qū)的小獸類宿主中巴爾通的基因型存在差異，這可能與不同地區(qū)小獸的優(yōu)勢種屬不同有關(guān)。

本研究首次在云南西北部高原地區(qū)檢測小獸宿主的感染情況，對該地區(qū)的巴爾通體研究奠定了基礎(chǔ)，而且該地區(qū)主要以畜牧業(yè)為主，人們在生產(chǎn)生活中易接觸到小獸類宿主，通過對小獸類宿主的感染調(diào)查研究對該地區(qū)巴爾通的防治提供了重要依據(jù)。