王繼勇，高云麗，左 洛，何 敏，陳 聰，李小軍

(1武漢理工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，武漢430070;2中南民族大學(xué)藥學(xué)院，武漢430074)

目前糖尿病的發(fā)病率呈持續(xù)上升狀態(tài)，且多以 II型糖尿病為主，而胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是II型糖尿病的重要病理生理基礎(chǔ)［1］.胰島素抵抗是機(jī)體在外圍組織對(duì)胰島素?cái)z取和清除葡萄糖能力受損［2，3］，導(dǎo)致代償性胰島素分泌增多.目前，國內(nèi)外對(duì)于胰島素抵抗模型建立的方法有自發(fā)型［4］，誘導(dǎo)型、轉(zhuǎn)基因型［5］等，其中誘導(dǎo)型動(dòng)物模型又分為高糖飲食誘導(dǎo)［6］、高脂飲食誘導(dǎo)［7］、藥物與飲食聯(lián)合誘導(dǎo)［4］.據(jù)鏈脲佐菌素(STZ)致糖尿病機(jī)理［8］和 STZ 造模的特點(diǎn)［9］，本文采用高糖高脂飲食結(jié)合小劑量STZ誘導(dǎo)II型糖尿病胰島素抵抗，通過體重、空腹血糖、葡萄糖耐量、胰島素水平、胰島素抵抗、肝糖原含量等指標(biāo)評(píng)價(jià)高糖高脂飲食及STZ對(duì)胰島素抵抗大鼠的影響.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

SPF級(jí)雄性 Wistar大鼠，120～150 g，5～6周(湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，00070294).按照質(zhì)量比:普通飼料50.0%，淀粉22.5%，蛋白質(zhì) 11.5%，脂肪10.0%，纖維 2.5%，維生素 0.75%，礦物質(zhì)2.75%，高溫焙干［10］配制高脂高糖飼料.三諾安穩(wěn)血糖儀與血糖試紙(長沙三諾生物傳感技術(shù)股份有限公司)，NAVIGATORTMXL電子天平(奧豪斯儀器常州有限公司)，胰島素測定試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)，肝糖原測定試劑盒(南京建成生物技術(shù)研究所)，Eppendorf.AG Centrifuge 5804R 22331 Hamburg(德國 Eppendorf公司)，GAMMA-5射線儀(South Korea SHINJIN MEDICS.INS)，低溫大容量多管離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，STZ(美國Sigma公司)，葡萄糖、水合檸檬酸、二水合檸檬酸三鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃，濕度30%～40%.大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為3組，每組8只:①正常組，普通飲食;②高糖高脂組，20%果糖水結(jié)合高糖高脂飲食;③高糖高脂+STZ組，20%果糖水結(jié)合高糖高脂飲食.

1.3 大鼠空腹血糖(FBG)測定和口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)

大鼠飼養(yǎng)6周后，禁食不禁水14～16 h，尾部采血，測定空腹血糖，記為OGGT實(shí)驗(yàn)0 min的血糖值，隨后各組大鼠口服2g/kg的葡萄糖溶液，測30，60，120 min的血糖值，作 OGTT的時(shí)間-血糖關(guān)系圖.

1.4 胰島素抵抗模型

將0.1 mol/L的檸檬酸溶液與0.1 mol/L的檸檬酸鈉溶液按1︰1.32比例混合，調(diào)節(jié)pH至4.4，配成0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，高溫滅菌，4℃保存.將STZ溶解于0.1 mol/L的檸檬酸鈉緩沖液，配制成濃度為1.2%的STZ溶液.大鼠飼養(yǎng)8周后，禁食不禁水16 h，高糖高脂+STZ組腹腔注射30 mg/kg的STZ溶液，正常組和高糖高脂組注射等劑量的檸檬酸緩沖液.糖尿病大鼠模型的標(biāo)準(zhǔn)為:禁食不禁水14～16 h，檢測各組大鼠空腹血糖和葡萄糖耐量，空腹血糖＞7.0mmol/L或120min血糖值＞11.1mmol/L.故確定胰島素抵抗模型標(biāo)準(zhǔn)為空腹血糖 ＜7.0mmol/L或120min 血糖值 ＜11.1mmol/L，但高于正常值.

1.5 大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?FBG測定及OGTT

大鼠飼養(yǎng)10周后，各組大鼠禁食不禁水14～16 h，尾部采血，測定空腹血糖.由于腹腔注射30 mg/kg STZ的正常大鼠與正常大鼠120 min血糖無顯著性差異［11］.故本實(shí)驗(yàn)中僅分析正常組、高糖高脂組和高糖高脂+STZ組的葡萄糖耐量情況，具體測定方法同上1.3.

1.6 大鼠胰島素水平及胰島素抵抗指數(shù)評(píng)價(jià)

大鼠飼養(yǎng)10周后，各組大鼠禁食不禁水14～16 h，尾部采血1～1.5 mL于含有EDTA抗凝劑的離心管，放于冰水浴中.4℃靜置30 min，3500 r/min離心15 min，分離上清，－20℃保存.按照碘［125I］胰島素放射免疫分析藥盒說明書測定各組大鼠血漿胰島素水平，按照公式［12］胰島素抵抗指數(shù)(HOMAIR)=空腹血漿胰島素×空腹血糖/22.5，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù).

1.7 大鼠肝糖原含量測定

大鼠飼養(yǎng)10周后，各組大鼠禁食不禁水14～16 h，頸椎脫臼處死，解剖取肝臟，計(jì)算肝臟指數(shù).取各組大鼠部分肝臟(weight≤100 mg)，迅速放入冰冷的生理鹽水漂洗，吸干水分稱重，按樣本重量:堿液體積=1︰3加入試管，沸水浴20 min，冷卻，加蒸餾水(蒸餾水體積=96×肝臟重量)，混勻，沸水浴5 min，冷卻，于620 nm波長下，空白管調(diào)零，測各管吸光度(OD).按照公式:肝糖原含量(mg/g組織)=測定管OD值/標(biāo)準(zhǔn)管OD值×標(biāo)準(zhǔn)管含量×100×10×1.11，計(jì)算大鼠肝糖原含量.

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 造模結(jié)果

按1.4對(duì)高糖高脂+STZ組注射STZ 48 h后，8只大鼠中7只造模成功，1只死亡，2周后造模成功大鼠均處于胰島素抵抗?fàn)顟B(tài).

2.2 大鼠體重變化

各組大鼠造模前皮毛有光澤，精神良好，造模后高糖高脂+STZ組毛發(fā)暗黃，精神萎靡，攝食量加大，飲水增多，排尿增多，體重下降，體重變化情況見圖1.由圖1可見，注射STZ前(1～8周)，各組大鼠體重增加較快.高糖高脂組和高糖高脂+STZ組與正常組相比，均有顯著性差異(p＜0.01)，故高脂飼料飲食可使大鼠體重增加，導(dǎo)致肥胖.注射STZ后，高糖高脂+STZ組體重較高糖高脂和正常組增加緩慢，說明STZ在一定程度上阻礙大鼠體重增加.

圖1 大鼠體重變化圖Fig.1 Body weight changes of rats

2.3 大鼠空腹血糖變化

大鼠空腹血糖變化見圖2.由圖2可見，注射STZ前(1～8周)，各組大鼠空腹血糖均維持在正常范圍(3.2～8.1mmol/L)，無顯著性差異，但高糖高脂組和高糖高脂+STZ組FBG略高于正常組.故高糖高脂飲食雖不能造成嚴(yán)重的空腹血糖受損，但在一定程度上使胰島代償功能低下，有糖尿病病癥的傾向.第9周注射STZ 48 h后，高糖高脂+STZ組中FBG均在10.0 mmol/L以上，高糖高脂+STZ組較正常組和高脂高糖組有顯著性差異(p＜0.01);注射STZ 2周后，大鼠FBG雖降至6.4 mmol/L，但較正常組和高脂高糖組仍有顯著性差異(p＜0.01)，可見，小劑量的STZ 2周后大鼠糖調(diào)節(jié)失常，處于高血糖狀態(tài).

圖2 動(dòng)物空腹血糖變化Fig.2 Fasting blood glucose changes of rats

2.4 大鼠口服葡萄糖耐量測定

注射STZ前，注射STZ 48 h和2周后，大鼠口服葡萄糖耐量測定結(jié)果見圖3.

圖3 不同時(shí)間大鼠注射口服葡萄糖耐量結(jié)果Fig.3 OGTT results in rats at different time

由圖3可見，整個(gè)過程中高糖高脂組的葡萄糖耐量較正常組受損，但無顯著性差異.注射STZ前(圖3a)各組大鼠在口服葡萄糖30 min后，血糖均明顯升高，較0 min有顯著性差異(p＜0.01);60 min時(shí)血糖明顯降低，120 min時(shí)，雖血糖值稍高于0 min(0.4 mmol/L)，但已降至正常范圍，且無顯著性差異.注射STZ 48 h后(圖3b)，高糖高脂+STZ組較正常組和高糖高脂組在兩組OGTT實(shí)驗(yàn)中血糖明顯增高，葡萄糖耐量異常顯著(p＜0.01).注射STZ 2周后(圖3c)，高糖高脂+STZ組在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖值均明顯下降約(50±10)%，糖耐量異常有所恢復(fù)，因?yàn)樾┝康腟TZ未完全摧毀胰島β細(xì)胞，仍具有分泌能力，隨著β細(xì)胞功能的逐漸恢復(fù)，糖耐量能力也逐漸恢復(fù)，保持在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài).

2.5 大鼠肝糖原含量和血漿胰島素測試

大鼠肝糖原含量和血漿胰島素測試結(jié)果見表1.由表1可見，正常組、高糖高脂組和高糖高脂+STZ組的肝糖原含量無顯著性差異.故高糖高脂和STZ對(duì)大鼠肝糖原的合成無太大影響.3組的胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.可見高糖高脂飲食對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能影響較小，小劑量STZ在一定程度上使該功能略有降低.

表1 各組肝糖原含量、空腹血漿胰島素水平、胰島素抵抗指數(shù)的測定Tab.1 Determination of the hepatic glycogen contents，fasting plasma insulin level，insulin resistance in each group

正常組、高糖高脂組和高糖高脂+STZ組的胰腺病理切片(20×)見圖4.由圖4可見，模型組的胰島較正常組均出現(xiàn)不同程度萎縮(藍(lán)圈標(biāo)記為胰腺島所在位置).

圖4 各組胰腺病理切片圖Fig.3 Pathological section diagrams from rat pancreas of different groups

3 討論

本研究表明:注射STZ前，高糖高脂組和高糖高脂+STZ組大鼠的體重明顯升高(p＜0.05);空腹血糖有不同程度的升高，但無顯著性差異;糖耐量略有異常;故短期高糖高脂飲食使大鼠體重增加，血糖升高，由于高糖高脂對(duì)胰島β細(xì)胞分泌胰島素的功能有阻礙，使其分泌胰島素能力下降.

注射STZ 48 h后，高糖高脂+STZ組的大鼠體重較高糖高脂組增加緩慢，空腹血糖急速上升，糖耐量異常改變，可見STZ可在短時(shí)間內(nèi)破壞胰島β細(xì)胞，使其分泌胰島素能力驟降，引起血糖驟升.注射STZ 2周后，高糖高脂+STZ組大鼠血糖值較注射STZ 48 h雖均大幅度降低，但較正常組仍有差異(p＜0.05);糖耐量異常程度好轉(zhuǎn).實(shí)驗(yàn)后期，高糖高脂+STZ組大鼠的肝糖原、胰島素水平和胰島素抵抗指數(shù)與高糖高脂組相比無太大差異，與正常組相比雖略有下降，但無顯著性差異.可見短時(shí)間內(nèi)高糖高脂飲食可使空腹血糖升高，但對(duì)胰島β細(xì)胞影響不大，小劑量的STZ可在短時(shí)間內(nèi)抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素的能力，作用迅速但可自行修復(fù)，胰島素敏感性指數(shù)雖然降低，但并未影響到肝臟糖代謝功能.

綜上所述，高糖高脂飲食雖對(duì)大鼠血糖、糖耐量、肝糖原及胰島素?zé)o顯著影響，但它可使血糖升高，糖耐量異常，胰島素減少，肝糖原合成減少.高糖高脂飲食8周，腹腔注射30 mg/kg STZ后，繼續(xù)高糖高脂2周可形成胰島素抵抗動(dòng)物模型.

［1］Stren M P.Diabetes and cardiovascular disease:the"common"hypothesis［J］.Diabetes，1995，44:369-374.

［2］Sowers J R，F(xiàn)rohlich E D.Insulin and insulin resistance:impact on blood pressure and cardiovascular disease［J］.Med Clin North Am，2004，88(1):63-82.

［3］李 蕾，李之俊，魏安奎，等.胰島素抵抗動(dòng)物模型和運(yùn)動(dòng)干預(yù)模型的建立和評(píng)價(jià)［J］.武漢體育學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，43(8):51-54.

［4］劉 微，李 冀，謝 田，等.胰島素抵抗動(dòng)物模型的研究進(jìn)展［J］.中醫(yī)藥信息，2008，25(6):9-11.

［5］喻 嶸，成細(xì)華，胡 偉，等.骨骼肌特異性胰島素樣生長因子1及胰島素雙受體功能缺失鼠糖尿病發(fā)病及其相關(guān)炎癥因子的變化［J］.中國臨床康復(fù)，2007，11(45):9075-9078.

［6］張 閩，楊 曄，劉 敏，等.果糖誘導(dǎo)的高血壓伴胰島素抵抗大鼠血清脂聯(lián)素腫瘤壞死因子α濃度的變化［J］.心肺血管病雜志，2007，26(1):48-50.

［7］趙永松，李玉光，趙曉云.高脂飲食對(duì)大鼠胰島素抵抗及氧化損傷指標(biāo)的影響及意義［J］.山西醫(yī)藥雜志，2007，36(8):675-677.

［8］Elsner M，Guldbakke B，Tiedge M，et al.Relative importance of transport and alkylation for pancreatic beta-cell toxicity of streptozotocin［J］.Diabetologia，2000，43(12):1528-1533.

［9］Saini K S，Thompson C，Winterford C M，et al.Streptozotocin at low doses induces apoptosis and at high doses causes necrosis in a murine pancreatic beta cell line［J］.J Biochem Mol Biol Int，1996，39(6):1229-1236.

［10］王俊賢，李小軍，劉躍輝，等.高糖、高脂誘導(dǎo)大鼠肝臟胰島素抵抗評(píng)價(jià)［J］.中國藥師，2012，15(6):747-751.

［11］文曉紅.鏈脲佐菌素致胰島破壞及其與高血糖關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究［D］.重慶:重慶醫(yī)科大學(xué)，2008:25.

［12］Gannon M C，Niewoehner C B，Nuttall F Q.Effect of insulin administration on cardiac glycogen synthase and synthase phosphatase activity in rats fed diets high in protein，fat or carbohydrate［J］.J Nutr，1985，115(2):243-251.