何冬蘭，葉 程，王亞南，覃 桂

(中南民族大學生命科學學院，武漢430074)

20世紀90年代，國外學者首次通過微生物發(fā)酵獲得谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶［1］，掀起了該酶的生產(chǎn)熱潮，微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶(MTG)，由于其在分子內(nèi)或分子間特殊的交聯(lián)作用，在食品、醫(yī)療、紡織等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，近年來對谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶的研究日益激烈，研究方向從該酶的應(yīng)用領(lǐng)域逐步轉(zhuǎn)向基因調(diào)控層面，探究提高該酶表達量或酶活性的方法.王坤等［2］將轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶酶原的基因序列進行密碼子優(yōu)化，降低其GC含量，提高了它在大腸桿菌中的表達水平.Marx C K等［3］利用隨機突變技術(shù)研究重組谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶耐熱穩(wěn)定性和熱敏感變體.

通過基因工程的方法可提高MTG酶活力.由于MTG在大腸桿菌中表達時會產(chǎn)生無活性的包涵體，需復(fù)性才能產(chǎn)生有活性的蛋白［4］，故MTG在原核中表達存在較大的缺陷.畢赤酵母是真核生物，能加工表達蛋白，本實驗構(gòu)建了帶有MTG基因的新型質(zhì)粒pPIC3.5 k-MTG轉(zhuǎn)入畢赤酵母中誘導(dǎo)表達，直接產(chǎn)生有活性的目的蛋白，為解決MTG生產(chǎn)成本過高、產(chǎn)量不能滿足食品工業(yè)需求等實際問題提供初步依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

重組菌株pPIC3.5k-MTG/DH5α為本實驗室構(gòu)建，Pichia GS115由中南民族大學生物工程實驗室提供.根據(jù)Streptomyces sp.H197基因序列，設(shè)計帶酶切位點的上游引物(BamHI:CGTGGATCCGCCAGCGGCGGCGACGGGGAAA)和下游引物(EcoR I:CGGAATTCTTACGGCCAGCCCTGCTT)，重組質(zhì)粒PCR鑒定引物合成，引物序列如下:5'AOX1 Primer GACTGGTTCCAATTGACAAGC;3'AOX1 Primer GCAAATGGCATTCTGACATCC.

ExTaq酶、限制性內(nèi)切酶EcoR I和 BamH I、蛋白marker(Takara公司)，DNA Marker(BBI公司)，凝膠回收試劑盒(Axygen公司)，G418、D-山梨醇、生物素(Amrecso，進口分裝).其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純.

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pPIC3.5k-MTG的提取、檢測和線性化

挑取重組菌pPIC3.5k-MTG/DH5α單菌落接種到2 mL含有適當抗生素的低鹽LB培養(yǎng)基中，于37℃劇烈搖蕩下培養(yǎng)過夜［5］.采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒.提取的重組質(zhì)粒經(jīng)0.8%凝膠電泳檢測后，－20℃?zhèn)溆?PCR檢測體系為25 μL，雙酶切檢測體系為10μL，37℃酶切4 h，2種檢測結(jié)果皆用 SDSPAGE凝膠電泳檢測［6］.對重組質(zhì)粒用Sac I酶切線性化，體系為 20 μL，含 10 × L buffer 2 μL，Sac I 1 μL，重組質(zhì)粒 pPIC3.5k-MTG 8 μL，ddH2O 9 μL，37℃反應(yīng)4h.反應(yīng)完畢后，SDS-PAGE電泳檢測回收，質(zhì)粒存于－20℃?zhèn)溆?

1.2.2 畢赤酵母感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化

將80 μL畢赤酵母感受態(tài)細胞置于冰上，加入10μL回收的線性化重組質(zhì)粒，冰上放置20 min，電擊轉(zhuǎn)化(2.0 kV，5 ms)，加入1 mL冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5 mL EP管中.涂布MD平板上，每個平板 600 μL，30℃ 培養(yǎng)，直至單菌落出現(xiàn)［7，8］.

1.2.3 Muts和 Mut+驗證

將轉(zhuǎn)化子分別點種于MM和MD培養(yǎng)基中，在MD平板正常生長而在MM平板上生長很小或不長的菌株為Muts型.

1.2.4 PCR 鑒定重組子

挑取單菌落于2 mL YPD培養(yǎng)基中30℃搖床培養(yǎng)過夜，收集菌體采用“煮-凍-煮”法提取酵母基因組，利用目的片段上游引物和下游引物加5'AOX1 Primer各配成25 μL體系PCR，含10×PCR反應(yīng)緩沖液(含 Mg2+)2.5 μL，dNTP(10 mmol/L)0.5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各 0.5 μL，Ex-Taq 酶(2.5 U/μL)0.5 μL，總 DNA 1.0 μL.檢測目的片段是否插入和插入方向是否正確(體系同上).反應(yīng)完畢后用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.2.5 Muts表型重組酵母的誘導(dǎo)表達

挑選一單菌落，置于裝有25 mL BMGY培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，于28～30℃，250～300 r/min培養(yǎng)至OD600=2～6(16～18 h)，室溫下1500～3000 g離心5 min，收集菌體，用BMMY重懸菌體(約100 mL)，所得的菌液分別置于100 mL的搖瓶中，每瓶10mL，用雙層紗布或粗棉布封口，于28～30℃，250～300 r/min搖床上繼續(xù)生長.每24 h向各培養(yǎng)基中添加100%甲醇至終濃度為1.0%，培養(yǎng)96 h后分別取菌液樣品1mL置于1.5 mL EP管中，14000 r/min離心 2～3 min，分別收集菌體.采用 SDSPAGE鑒定重組蛋白的表達，分析目的蛋白的表達量，取樣時間0，24，48，72，96 h.

1.2.6 蛋白的檢測、純化和酶活測定

將取樣用蝸牛酶破壁處理離心收集上清，加入上樣緩沖液沸水浴5 min，離心.取20 μL點樣，濃縮膠穩(wěn)壓90 V，25 min.分離膠穩(wěn)壓120V，60 min.電泳后剝膠，將凝膠小心放入固定液中固定15 min，再放入考馬斯亮藍染色液浸泡，室溫水平搖床搖1～2 h.將凝膠浸泡入考馬斯亮藍脫色液中，室溫水平搖床搖2～3 h，其間更換脫色液3～4次，觀察蛋白電泳結(jié)果.將收集的樣品裝至透析袋1/3，每8 h更換一次透析液.更換3次后離心收集沉淀，透析后樣品SDS-PAGE檢測效果并利用 Grosswicz比色法［9］測定酶活:以N-a-CBZ-Gln-Gly為作用底物，以L-谷氨酸γ-單羥胺酸(氧肟酸)作標準曲線.一個單位MTG酶活單位(U/mL)定義為在37℃、pH 6.0的條件下反應(yīng)l min生成1 mol氧肟酸的量.

2 結(jié)果

2.1 提取的重組質(zhì)粒及驗證

從培養(yǎng)的重組菌pPIC3.5k-MTG/DH5α提取重組質(zhì)粒，用1%瓊脂糖凝膠電泳，PCR和酶切驗證，由圖1可知提取的重組質(zhì)粒大小約為10kb.

2.2 重組質(zhì)粒的驗證

對重組質(zhì)粒鑒定采用上游引物和3'AOX1進行PCR得到位于1.5 kb附近的片段(見圖2中7～10)，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功且方向正確.將提取的重組質(zhì)粒進行EcoR I和BamH I雙酶切，得到位于9 kb附近的pPIC3.5k質(zhì)粒和1.2 kb附近的目的片段(見圖3)，進一步驗證重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

2.3 重組質(zhì)粒線性化

對重組質(zhì)粒經(jīng)行線性化，結(jié)果見圖4，線性化后的重組質(zhì)粒位于10 kb處左右，驗證pPIC3.5k質(zhì)粒中帶有目的片段.

2.4 重組子Muts驗證及PCR鑒定

圖1 重組質(zhì)粒pPIC3.5k/MTG電泳結(jié)果Fig.1 electrophoresis results of recombinant plasmids pPIC3.5k/MTG

圖2 重組質(zhì)粒進行PCR驗證結(jié)果Fig.2 PCR identification of recombinant plasmids

圖3 對重組質(zhì)粒進行雙酶切驗證結(jié)果Fig.3 Restriction identification of recombinant plasmid

圖4 重組質(zhì)粒線性化驗證Fig.4 Linearized identification of recombinant plasmid

將平板上的轉(zhuǎn)化子接種到MM和MD培養(yǎng)基上，經(jīng)過3d培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)MM平板上的單菌落大于MD平板上的菌落，所以確定轉(zhuǎn)化子為Muts型(見圖5).對重組子進行上游引物+3’AOX進行PCR驗證得到了目的片段，驗證了重組子中插入了目的序列并且插入方向正確(見圖6).

圖5 重組子Muts的鑒定Fig.5 Identification of recombinant Muts

圖6 重組子PCR鑒定結(jié)果Fig.6 PCR identification of recombinant

2.5 SDS-PAGE膠檢測結(jié)果

通過SDS-PAGE電泳檢測MTG重組蛋白位于37～50 kD之間(如圖7)，約在47 kD處，說明誘導(dǎo)表達出了目的蛋白.經(jīng)TotalLab 2.0軟件分析，利用1%甲醇誘導(dǎo)72 h后蛋白表達量最大.

2.6 透析純化

表達蛋白透析純化后結(jié)果由表8可見蛋白經(jīng)透析純化后蛋白量明顯增加.

圖7 不同誘導(dǎo)時間MTG表達的SDS-PAGE電泳分析Fig.7 Analysis of MTG protein by SDS-PAGE at different induction time

圖8 透析純化結(jié)果Fig 8 Results of dialysis purification

2.7 酶活的測定結(jié)果

由圖8結(jié)果可知，蛋白樣品經(jīng)透析純化后，經(jīng)Total Lab 2.0凝膠分析軟件分析蛋白濃度增加了2.35倍，將純化后的蛋白測其 OD492=0.0181，稀釋后據(jù)酶活計算公式得酶活(發(fā)酵液)為0.5013U/mL.

3 討論

巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)是近年來國內(nèi)外廣泛使用的一種新型表達系統(tǒng)，該表達系統(tǒng)除具有真核表達系統(tǒng)所具有的特點外，還具有成本低、產(chǎn)量高和利于規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點［9］.故將MTG基因轉(zhuǎn)入畢赤酵母中進行表達直接產(chǎn)生有活性的目的蛋白，解決目前轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶生產(chǎn)成本過高、產(chǎn)量不能滿足食品工業(yè)需求等問題，促進轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)與其在食品等工業(yè)中的廣泛應(yīng)用，透析純化時pH要調(diào)到離蛋白樣品等電點遠些，防止產(chǎn)生沉淀，本實驗成功獲得含有目的基因的重組畢赤酵母菌并測定酶活，利用1%濃度甲醇對酵母菌表達微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶進行誘導(dǎo)純化后，目的蛋白濃度提高了2.35倍，酶活達到0.5013U/mL.為進一步優(yōu)化重組菌表達條件，純化蛋白和提高酶活研究進行了前期工作，為探索開發(fā)全新的谷氨酰胺轉(zhuǎn)胺酶提供了客觀的實驗依據(jù).

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