陳思禮，鎮(zhèn) 慧

(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

藻膽蛋白是存在于藍(lán)藻、紅藻和隱藻中的一類同源蛋白家族.藻膽蛋白在體內(nèi)生物合成的最后一步為色素基團(tuán)與脫輔基藻膽蛋白的連接而成.在藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)，藻膽蛋白的某些位點(diǎn)與色素基團(tuán)的連接是自發(fā)的，這位點(diǎn)本身具有裂合酶的功能，而某些位點(diǎn)上藻膽色素與脫輔基藻膽蛋白的正確連接需要特異的裂合酶來催化完成.研究發(fā)現(xiàn)藻紅藍(lán)蛋白裂合酶PecE、PecF能夠組裝成異源二聚體，行使膽蛋白裂合酶的催化功能，催化藻膽蛋白β亞基153位半胱氨酸殘基與藻膽色素的連接，PecE和PecF通過使藻藍(lán)色素PCB異構(gòu)化形成PVB使之與脫輔基蛋白 PecA連接［1］.Zhao經(jīng)研究 首次在 魚腥 藻PCC7120中發(fā)現(xiàn)了與藻藍(lán)蛋白β亞基合成相關(guān)的類裂合酶CpeS，它能夠催化β亞基Cys-153與色素基團(tuán)的結(jié)合［2］.另一種特異催化藻藍(lán)蛋白β亞基合成的蛋白CpcT也在聚球藻PCC7002中發(fā)現(xiàn)［3］.

采用 BLAST軟件同源性搜索，在集胞藻PCC6803基因組中我們發(fā)現(xiàn)與cpcT具有同源性的基因ssl1690.本實驗利用分子生物學(xué)手段，構(gòu)建出ssl1690基因缺失體，通過觀察基因缺失株的表型，預(yù)測基因功能.

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TG1和克隆載體pBluescript SK(+)質(zhì)粒為本實驗室保存.集胞藻 PCC6803(Synechococcus sp.PCC6803)購于中科院水生生物研究所淡水藻種庫(FACHB).PCR反應(yīng)所需試劑，DNA凝膠回收試劑盒，限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶等均購自北京天根生化科技有限公司.

1.2 缺失體載體的構(gòu)建

缺失體載體的構(gòu)建是將ssl1690在基因組兩側(cè)序列克隆至pBluescript SK(+)載體中，并通過酶切、連接將抗性基因卡那霉素插入到上下游同源臂間.

基因組的提取:采用超聲破碎法提取總DNA.離心收集對數(shù)期藍(lán)藻細(xì)胞，重懸于CTAB中，利用超聲波破碎細(xì)胞，再加入蛋白酶K，37℃恒溫水浴1 h后，使用酚氯仿法［4］提取總DNA.

上下游同源臂的克隆:根據(jù)集胞藻PCC6803基因組信息和ssl1690的遺傳圖譜，設(shè)計上下游同源序列的 PCR 引物:P1、P2、P3、P4(見表1)，以提取的集胞藻PCC6803基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增采用梯度PCR反應(yīng)，程序為:94℃5 min預(yù)變性;94℃30 s，65～50℃(每循環(huán)降 0.5℃)1 min，72℃1 min循環(huán)30 次;94℃30 s，50℃1 min，72℃1 min 循環(huán)15次;72℃延伸10 min.擴(kuò)增后回收PCR產(chǎn)物，用限制性內(nèi)切酶消化后將其連入同樣酶切過的pBluescript SK(+)質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pBlue-L-R.將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TG1中，篩選陽性克隆，抽質(zhì)粒后送南京金斯瑞公司測序驗證.

卡那霉素抗性基因的插入:利用PCR的方法，將卡那霉素抗性基因從Pet-28a(+)質(zhì)粒中獲取，上下游引物為K1，K2(見表1)，回收、酶切后，連接至同樣酶切處理過的 pBlue-L-R重組載體上，得到pBlue-L-kan-R重組載體.

表1 引物序列Tab.1 Sequence of primers

1.3 集胞藻的自然轉(zhuǎn)化

［5］，將集胞藻PCC6803培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，收集集胞藻細(xì)胞，用新鮮的BG11培養(yǎng)基重懸，使細(xì)胞濃度約7×108，取100 μL重懸細(xì)胞于離心管中，加入重組質(zhì)粒pBlue-L-kan-R的溶解液30 μL，使質(zhì)粒 DNA 的終濃度不少于 50 μg/mL.將此混合液25℃溫育6 h后涂布于含卡那霉素的BG11平板上，30℃連續(xù)光照下誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)后鑒定.

1.4 突變株的表型觀察

將突變株接種于BG11液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，自接種當(dāng)日起，每12 h測1次活細(xì)胞生物量，并以野生型為對照，觀察其生長狀態(tài).

1.5 SDS-PAGE 電泳

運(yùn)用超聲方法提取藻膽體［6］，進(jìn)行 SDS-PAGE電泳檢測，分析突變株的藻膽體表達(dá)情況.

2 實驗結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，用引物P1、P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條1001 bp的上游同源臂條帶，用引物P3、P4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條1001 bp的下游同源臂條帶，用引物K1、K2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到1條960 bp的卡那霉素抗性基因條帶.所得片段電泳結(jié)果如圖1所示.

2.2 突變株

自然轉(zhuǎn)化的和野生型集胞藻PCC6803在BG11卡那霉素抗性平板上培養(yǎng)后，其生長情況如圖2所示.由圖2可見，突變型集胞藻PCC6803因含卡那霉素抗性基因，因此能在平板上生長，而野生型以及未轉(zhuǎn)化成功的藍(lán)藻藻細(xì)胞不能在抗性平板上正常生長.

圖1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis identification of PCR product

圖2 卡那霉素抗性平板的篩選Fig.2 Kanamycin resistance plate screening

2.3 突變株與野生株生長情況比較

在光照強(qiáng)度為2000 Lux，25℃連續(xù)光照下培養(yǎng)，藻液顏色呈黃綠色，而野生株的藻液呈深綠色:說明突變株出現(xiàn)了漂白現(xiàn)象.而在光照強(qiáng)度為600 Lux下連續(xù)光照培養(yǎng)，2種藻液均出現(xiàn)了漂白現(xiàn)象.因此推測，ssl1690基因所表達(dá)的蛋白與光合作用有關(guān).

在正常培養(yǎng)條件下，定期取野生株和突變株的藻液測定OD730值繪制生長曲線見圖3.如圖3所示，突變型藍(lán)藻的生長速度較野生型藍(lán)藻慢，生長對數(shù)期延遲.在BG11培養(yǎng)基中，藻類主營異養(yǎng)生活，在光照充分的情況下，這種遲緩的生長是光合作用不能正常進(jìn)行的表現(xiàn)，推斷基因ssl1690與光合作用有關(guān).

2.4 SDS-PAGE 電泳結(jié)果

將野生型集胞藻與突變型集胞藻按超聲方法提取并分離藻膽體蛋白，并進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果如圖4所示.從圖4可見，突變型的藻膽體組分有所減少，即突變型的藻膽體蛋白有部分缺失.

圖3 基因缺失突變株與野生型藍(lán)藻生長曲線比較Fig.3 Comparision of wild type growth curve with deletion mutant strain

圖4 藻膽體蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.4 The SDS-PAGE of phycobiliprotein

3 討論

為研究ssl1690基因是否與裂合酶基因cpcT功能相同或相似，通過本實驗進(jìn)行了初步探討.

首先，利用PCR的方法將ssl1690基因的兩側(cè)序列克隆到pBluescript SK(+)質(zhì)粒載體上，并將卡那霉素抗性基因插入到兩側(cè)序列之間，得到同源重組質(zhì)粒載體(pBlue-L-kan-R).運(yùn)用此方法成功構(gòu)建出ssl1690同源缺失突變載體，且所得的同源重組載體較大，保證了其在轉(zhuǎn)入藍(lán)藻細(xì)胞時更易發(fā)生同源重組，產(chǎn)生雙交換［7］，從而在一定程度上保證了基因敲除的成功性.其次，利用集胞藻PCC6803在自然條件下能較高的吸收外源DNA，將同源重組載體通過自然轉(zhuǎn)化的方法得到突變株.一般而言，在對數(shù)期的藍(lán)藻細(xì)胞更易吸收外源DNA，環(huán)狀的DNA比鏈狀DNA更易發(fā)生轉(zhuǎn)化，此外，適當(dāng)提高濃度或延遲DNA與藻液的混合時間也能促進(jìn)轉(zhuǎn)化效率的提高［6，8，9，10］.

本實驗發(fā)現(xiàn)，所得到的集胞藻PCC6803缺失突變株出現(xiàn)的漂白現(xiàn)象，與藍(lán)藻藻細(xì)胞的生長環(huán)境無關(guān).研究表明，在cpcT基因缺失的突變株中藻膽蛋白的合成受阻，cpcT能催化藻膽色素與藻膽蛋白上的Cys-153結(jié)合，而此位點(diǎn)上藻膽素的缺失可能導(dǎo)致β亞基無法與α亞基正常結(jié)合，使藻膽體不能正常組裝.β153生色基團(tuán)在藻膽體上位于外部邊緣處，其主要功能是吸收光能并把能量傳遞到作為終受體的 β82 為生色基團(tuán)上［2，11］.本實驗藍(lán)藻細(xì)胞在表型上出現(xiàn)漂白現(xiàn)象是由于β153位上的生色基團(tuán)未與脫輔基藻膽蛋白正常結(jié)合，使藻藍(lán)蛋白不能正常裝配，進(jìn)一步使藻膽體的生物合成受阻所致.

針對藻膽蛋白裂合酶的研究，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)cpcT、cpeT、cpcE及cpcF等基因均有裂合酶功能，而藻藍(lán)蛋白作為重要光合作用元件，了解并掌握其生物合成機(jī)制，為研究光合作用機(jī)制和藍(lán)藻細(xì)胞生理打下了基礎(chǔ)，并對藍(lán)藻引發(fā)的水華治理有重要的指導(dǎo)意義.

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