李步海，石熒原

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，分析化學(xué)國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢430074)

秸稈是地球上儲(chǔ)量巨大的可再生資源，但秸稈中天然纖維素成分的結(jié)晶度高、分子間和分子內(nèi)存在大量的氫鍵，難溶于大多數(shù)溶劑，是秸稈在應(yīng)用開(kāi)發(fā)中的最大障礙［1，2］.盧煒［3］以油菜秸稈為原料提取天然的纖維素，在離子液體中用馬來(lái)酸酐等改性秸稈纖維素，并用于 Cu(II)、Cd(II)、Pb(II)和 Hg(II)的吸附，改性后的吸附劑對(duì)重金屬離子的最大吸附量比未改性前提高了約2～3倍.但合成離子液體價(jià)格昂貴，改性操作繁雜費(fèi)時(shí).Mucalo M.R.等［4］用磷酸化纖維素制成一種新型生物吸附劑，用于吸附細(xì)胞色素C，較未磷酸化纖維素獲得較好的吸附效果.

近年來(lái)，用吸附的方法分離和純化蛋白質(zhì)的研究主要通過(guò)靜電作用、離子交換、氫鍵、親和吸附選擇性吸附或特異性結(jié)合目標(biāo)蛋白［5］.Tanyolac D.等［6］利用多孔聚乙烯丁醛表面的－OH吸附牛血清白蛋白(BSA).胡杰等［7］利用磺化的聚甲基丙烯酸甲酯微球吸附BSA.張靜等［8］利用辛巴藍(lán) F－3GA修飾的殼聚糖微球吸附BSA.吳暉等［9］研究了膠原固載Zr(Ⅳ)親和吸附材料對(duì)牛血清蛋白的吸附特性.

本文選用新的基質(zhì)－油菜秸稈纖維素，以二甲基甲酰胺為交聯(lián)劑，用磷酸修飾制備一種新型生物吸附劑，并考察了吸附劑對(duì)BSA的吸附性能的影響因素.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

熒光/磷光/發(fā)光光度計(jì)(LS－55型，美國(guó) PE公司)，傅里葉紅外光譜儀(NEXUS 470智能型，美國(guó)珀金一埃爾默公司)，X射線光電子能譜儀(VG Multilab 2000)，手提式中藥粉碎機(jī)(青州天地中藥設(shè)備廠)，精密酸度計(jì)(pHS－3C型，上海虹益儀表有限公司)，透射電子顯微鏡(Tecanai G220 S－TWIN，200 kv，F(xiàn)EI公司).

牛血清白蛋白BSA(Sigma公司)，二甲基甲酰胺(SY國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，磷酸(武漢化學(xué)試劑廠)，尿素(重慶化學(xué)試劑廠).

油菜秸稈取于武漢市周邊田間，油菜秸稈用粉碎機(jī)打碎過(guò)篩，選取100～200目顆粒.

1.2 吸附劑的制備

1.2.1 油菜秸稈纖維素的預(yù)處理

干燥的油菜秸稈粉末先用甲苯－無(wú)水乙醇混合液脫盡蠟質(zhì).用去離子水80℃浸2 h過(guò)濾.未濾過(guò)的物質(zhì)用次氯酸鈉處理.以10% 醋酸調(diào)pH為0.4～3.8，75℃加熱2 h.過(guò)濾后20℃以10%NaOH提取10 h再過(guò)濾.用去離子水洗至pH中性，再用95%乙醇洗，50℃真空干燥16 h備用.

1.2.2 磷酸化油菜秸稈纖維素吸附劑的制備

取5.028 g預(yù)處理后油菜秸稈纖維素粉于500 mL圓底燒瓶中，加入200 mL二甲基甲酰胺，40.2 g尿素，33.9 g磷酸溶液，于205℃下反應(yīng)2 h.水洗至中性，40℃下真空干燥20 h得磷酸化油菜秸稈纖維素吸附劑.

1.3 油菜秸稈纖維素吸附劑的表征

1.3.1 紅外光譜

用KBr壓片，F(xiàn)TIR檢測(cè)400～4000 cm－1處的光譜吸收，觀察修飾前后油菜秸稈纖維素粉表面官能團(tuán)的變化.

1.3.2 TEM 表征

樣品與無(wú)水乙醇混合后超聲分散，用毛細(xì)管吸取樣品溶液滴于表面附有碳膜的銅網(wǎng)上，待樣品晾干后，進(jìn)行TEM測(cè)試，觀察微球的粒徑大小和分布情況.

1.3.3 XPS 能譜

用XPS分析修飾前后吸附劑表面的各元素組成的變化(主要為O，P和C)，干燥的樣品表面在10～8 托真空度條件下，用 3.6 keV Mg X－ray分析，譜圖用284.6 eV 的C1s基碳峰校正，Avantage 4.54軟件擬合.

1.4 吸附試驗(yàn)

分別稱取20.0 mg磷酸化改性和原始油菜秸稈粉微球，置于25 mL錐形瓶中，加10.0 mL不同pH值緩沖溶液，0.4 mg/mL的 BSA，放入搖床(轉(zhuǎn)速120 r/min)吸附20 h后離心.用熒光分光光度法測(cè)定上清液中剩余牛血清白蛋白的濃度.按式(1)計(jì)算吸附劑吸附率E.

式中C0為吸附溶液中加入的BSA初始濃度(mg/mL)，Ce為吸附后上清液中BSA的濃度(mg/mL).

1.5 洗脫實(shí)驗(yàn)

吸附完畢后離心，棄上清液，加入10.0 mL洗脫劑溶液，將錐形瓶放入搖床(轉(zhuǎn)速120 r/min)振蕩洗脫，20 h后離心.取上清液測(cè)定洗脫下來(lái)的目標(biāo)組分的含量，按式(2)計(jì)算洗脫率W.

式中C1為洗脫液中BSA濃度(mg/mL).

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附劑的表征

2.1.1 紅外光譜分析

圖1 未修飾和修飾后秸稈粉的紅外光譜Fig.1 FTIR spectra of cole straw before and after modification

未修飾和修飾后的秸稈粉紅外光譜如圖1所示.由圖1可見(jiàn)，3421 cm－1為O－H的伸縮振動(dòng)吸收峰，修飾后明顯減弱，表明－OH參與修飾反應(yīng)，修飾后的秸稈纖維素紅外光譜在1052 cm－1有P－O伸縮振動(dòng)，并且峰較修飾前明顯，說(shuō)明秸稈纖維素已成功磷酸化.

2.1.2 透射電子顯微鏡表征(TEM)

未修飾和修飾后的秸稈TEM圖如圖2所示.由圖2可見(jiàn)，未修飾前秸稈粉表面光滑規(guī)整，修飾后秸稈粉層次較薄，表面不規(guī)整，有毛絨化，碎片化等明顯特征.這是因?yàn)榻斩挿墼谛揎椃磻?yīng)后，表面結(jié)構(gòu)分解碎裂造成表面損傷.說(shuō)明吸附劑修飾后，表面增加了一定數(shù)量的活性基團(tuán)，表面積增大了.

圖2 秸稈粉的透射電子顯微鏡圖譜Fig.2 TEM of cole straw before and after modification

2.1.3 XPS 能譜分析

修飾前后秸稈粉吸附劑表面C、O、P三種元素的面積之比見(jiàn)表1.如表1所示，修飾后吸附劑表面各元素的比例發(fā)生了較大變化，氧元素的比例提高很大，由原來(lái)的16.56%提高到33.81%，磷元素由0.28%提高到0.58%.原因是經(jīng)修飾后，纖維素吸附劑表面增加了大量的磷酸基等活性基團(tuán)，氧、磷元素的比例也相應(yīng)增加;并有明顯的P2p峰，表明元素P成功地修飾到了秸稈粉吸附劑的表面，與紅外解析一致，見(jiàn)圖3.

表1 未修飾和修飾后秸稈粉吸附劑各元素比例比較Tab.1 Comparison of element proportions of the biomass before and after modification

圖3 未修飾和修飾后秸稈粉吸附劑的能譜圖Fig.3 XPS scan of the unmodified and modified biomass

2.2 不同條件對(duì)磷酸化油菜秸稈纖維素粉微球吸附BSA的影響

2.2.1 溶液pH 的影響

溶液pH對(duì)BSA吸附率的影響見(jiàn)圖4.由圖4可見(jiàn)，隨著溶液pH值的增大，纖維素對(duì)BSA的吸附率先增大后減小.修飾后纖維素粉在溶液pH值為6時(shí)達(dá)到最大吸附率.BSA的等電點(diǎn)約為pH值4.8，當(dāng)溶液pH值低于4.8時(shí)，BSA帶正電荷，吸附劑表面由于羧基的離群，表面帶負(fù)電荷，此時(shí)吸附劑與蛋白質(zhì)之間的作用以靜電引力為主;在等電點(diǎn)附近時(shí)，BSA呈電中性，此時(shí)，疏水作用成為吸附的主要驅(qū)動(dòng)力，因此吸附率繼續(xù)增大;在pH值為6時(shí)達(dá)到最大.當(dāng)溶液pH值繼續(xù)增大時(shí)，蛋白質(zhì)表面所帶負(fù)電荷增多，吸附劑與蛋白質(zhì)之間的靜電斥力使其吸附率降低.原始油菜秸稈纖維素粉表面的活性基團(tuán)較少，在低pH時(shí)(＜蛋白質(zhì)的PI)，靜電引力較小，故吸附率較低.

圖4 溶液pH與BSA吸附率的關(guān)系Fig.4 Effect of pH on BSA adsorption efficiency

2.2.2 吸附時(shí)間的影響

不同的吸附時(shí)間對(duì)磷酸化油菜秸稈纖維素粉的吸附性能的影響見(jiàn)圖5.如圖5所示.修飾纖維素粉在吸附進(jìn)行15 h后達(dá)到吸附平衡，原始纖維素粉在吸附20 h后達(dá)到平衡.根據(jù)不同吸附劑的性質(zhì)，確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)吸附時(shí)間為20 h.因?yàn)樾揎椇笪絼┫啾刃揎椙?，表面有更多的活性基團(tuán)，能更快達(dá)到吸附平衡.

圖5 反應(yīng)時(shí)間與BSA吸附率的關(guān)系Fig.5 Effect of contact time on BSA adsorption efficiency

2.2.3 BSA 初始濃度的影響

牛血清白蛋白的初始濃度與未修飾、磷酸修飾纖維素粉吸附量的關(guān)系見(jiàn)圖6.由圖6可見(jiàn)，隨著牛血清白蛋白初始濃度的增加，兩種吸附劑的吸附量逐漸增加.趨于吸附飽和后，吸附量基本不變.未修飾纖維素粉在牛血清白蛋白初始濃度為0.7 mg/mL時(shí)，達(dá)到最大吸附容量值68.98 mg/g;磷酸修飾纖維素粉在0.9 mg/mL，吸附容量達(dá)最大值127.39 mg/g，是未修飾的1.85倍.

圖6 BSA初始濃度與吸附量的關(guān)系Fig.6 Effect of BSA initial concentration on adsorption capacity

用 Langmuir［10］和 Freundlich［11］方程模擬 2 種吸附劑的吸附過(guò)程，所得相關(guān)系數(shù)列于表2.從模擬結(jié)果可見(jiàn)，Langmuir模型所得直線的相關(guān)系數(shù)優(yōu)于Freundlich模型，用Langmuir模型方程式算出的未修飾和修飾后的吸附劑最大吸附容量的理論值(73.96、133.51mg/g)和 實(shí) 驗(yàn) 值 (68.98、127.39 mg/g)能較好的吻合，故油菜秸稈纖維素吸附劑和磷酸修飾纖維素吸附劑對(duì)BSA的吸附過(guò)程可能只存在一種類型的吸附機(jī)制，兩種吸附劑對(duì)BSA的吸附為單分子層吸附(圖7).

Langmuir等溫吸附方程為:

線型方程為:

qe平衡吸附量mg/g;Ce平衡濃度mg/L;qm是理論最大吸附量mg/g.

Freundlich等溫式是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)公式，沒(méi)有假設(shè)條件，方程式如下:

線性方程為:

其中，K(L/mg)和n是經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，qe(mg/g)是平衡時(shí)的吸附容量，Ce(mg/L)是吸附平衡時(shí)溶液中吸附質(zhì)的濃度.

表2 纖維素對(duì)BSA吸附的Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬參數(shù)Tab.2 Langmuir and Freundlich parameters for the absorption of BSA

圖7 Langmuir和Freundlich吸附等溫線模擬圖Fig.7 Langmuir and Freundlich isotherms for BSA adsorption

2.2.4 吸附溫度

25～45℃時(shí)，溫度對(duì)牛血清白蛋白吸附率的影響不大，但溫度的升高使部分蛋白質(zhì)變性，為保持較高的活性和方便操作，吸附溫度選定25℃.

2.2.5 離子強(qiáng)度的影響

NaCl濃度對(duì)BSA吸附率的影響見(jiàn)圖8.由圖8可見(jiàn)，隨著溶液中NaCl濃度的增大，2種吸附劑對(duì)BSA的吸附率均明顯下降.因?yàn)殡x子強(qiáng)度增加，雙電層增厚，蛋白質(zhì)與吸附劑結(jié)合的空間阻礙和靜電排斥力加大;此外，溶液中離子濃度高時(shí)或極性增加時(shí)，蛋白質(zhì)得到更大的穩(wěn)定性，平衡往脫附方向移動(dòng)，造成吸附率降低.

圖8 NaCl濃度對(duì)BSA吸附率的影響Fig.8 Effect of NaCl concentration on adsorption ratio

2.2.6 BSA 的洗脫

NaCl和NaSCN溶液在不同濃度下作為洗脫劑對(duì)BSA的洗脫效果見(jiàn)圖9.由圖9可見(jiàn)，隨洗脫劑濃度的增加，洗脫率增大，當(dāng) c(NaCl)＞1.0 mol/L，c(NaSCN)＞0.8 mol/L后洗脫率下降，NaCl和NaSCN的最大洗脫率分別為54.68%，42.26%.NaCl對(duì)BSA的脫附效果更好.這是因?yàn)辂}濃度升高，離子強(qiáng)度增大，雙電層增厚，BSA與吸附劑配體間的靜電結(jié)合力和疏水作用減弱.其次，Cl－1相比SCN－1更活躍與自由，故能更好地穩(wěn)定蛋白質(zhì).

圖9 不同洗脫劑對(duì)BSA洗脫率的影響Fig.9 Effect of varying eluants on BSA elution ratio

3 結(jié)語(yǔ)

用磷酸化油菜秸稈纖維素粉微球，制備的生物吸附劑可選擇吸附BSA.因其表面有更多的活性基團(tuán)，其具有吸附平衡快，吸附容量大等優(yōu)點(diǎn).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明磷酸化油菜秸稈纖維素粉微球?qū)SA的最大吸附容量為127.39 mg/g，而未修飾油菜秸稈纖維素粉微球?qū)SA的最大吸附容量只有68.98 mg/g，表明改性能獲得較好的吸附性能.吸附劑的吸附等溫線符合Langmuir方程，屬單分子層吸附.

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