齊 巖，黃 波，司晉源，張名霞，張秋航＊

（1.首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，北京100053；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院 鼻咽癌研究所）

近年來(lái)的研究顯示小G蛋白可能是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Rac1和Cdc42的定位隨著細(xì)胞不斷移動(dòng)而發(fā)生改變，提示了Rac1和Cdc42與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能相關(guān)。Itoh等研究指出Rac1具有調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、片層偽足和細(xì)胞膜皺褶形成的功能，而這些改變是腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的早期事件[1]。本研究通過(guò)觀察鼻咽癌組織中Rac1及Cdc42的表達(dá)，探討Rac1和Cdc42信號(hào)分子可能參與鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)S－P法檢測(cè)鼻咽癌標(biāo)本腫瘤組織與鼻咽正常上皮組織中Rac1和Cdc42的表達(dá)，并探討其表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系，以及各分子標(biāo)志物之間的相互關(guān)系及其在鼻咽癌侵襲轉(zhuǎn)移中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 所有組織標(biāo)本均來(lái)自2003年9月至2004年9月于廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院耳鼻喉頭頸外科二區(qū)門診就診的病人，共102例，所有患者初診時(shí)經(jīng)病理組織學(xué)檢查確診。按1991年WHO分類法分為低分化鱗癌和未分化非角化型癌。均未經(jīng)治療。20例對(duì)照組為門診要求體檢的正常人群鼻咽部活檢組織，病理診斷均鼻咽正常上皮組織。經(jīng)廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)通過(guò)，所有參與實(shí)驗(yàn)的患者均簽署知情同意書。組織標(biāo)本活檢后生理鹽水沖洗潔凈，置于10%中性福爾馬林液中固定用于免疫組化。

全部患者治療后第一年內(nèi)每隔3個(gè)月、第2－3年每隔6個(gè)月、3年以后每年復(fù)查一次；隨訪包括鼻內(nèi)鏡、胸片、B超、CT、MRI等相關(guān)檢查。采用門診復(fù)查、信訪或電話隨訪，全部患者至少隨訪5年以上，末次隨訪時(shí)間為2009年3月，其中4例失訪，隨訪率為96.1%，失訪者按死亡處理。獲得患者的臨床資料包括病史、體格檢查、病理檢查、CT、骨掃描、超聲檢查、MRI檢查以確定其臨床分期。102例患者中，男性患者76例，女性26例，年齡在20到84歲之間。根據(jù)1998年AJCC標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱ期患者25例，Ⅲ期患者58例，Ⅳ期患者19例，詳見(jiàn)表3。

102例鼻咽癌患者均予以根治性放療，Ⅲ期和Ⅳ期患者聯(lián)合化療（MEPFL方案）。采用6MV－X線常規(guī)分割照射，每次DT2Gy，每天一次，每周5次。鼻咽部原發(fā)病灶設(shè)雙側(cè)面頸聯(lián)合野，放療至DT34－40Gy后縮野改為耳前野繼續(xù)外照射至DT60－70Gy，6－8周完成。頸部設(shè)頸前切線野，無(wú)頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶則外照射至DT50Gy，5周完成，有頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶則外照射至DT60－70Gy，6－8周完成。脊髓和腦干劑量控制在以40Gy以下。

1.2 檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)，抗體為Rac1鼠抗人單克隆抗體（Abcam公司ab－33186美國(guó)）和CDC42鼠抗人單克隆抗體（Santa CruzSC－872美國(guó)）。免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)參照陳豐霖等的方法：采用雙盲法，觀察切片至少5個(gè)以上具有代表性的高倍視野，不少于1000個(gè)細(xì)胞，對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行評(píng)估[2]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS11.0分析軟件，免疫組化的數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)及四格表確切概率法。相關(guān)性Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

生存時(shí)間按月計(jì)算。主要應(yīng)用了Kaplan－Meier統(tǒng)計(jì)方法，將Rac1和Cdc42免疫組化蛋白表達(dá)的量值按（－）和（＋）為低表達(dá)組，（＋＋）和（＋＋＋）為高表達(dá)組進(jìn)行分組，分別計(jì)算了總生存概率及無(wú)瘤生存率。組間比較應(yīng)用了Log－rank方法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)及趨勢(shì)檢驗(yàn)。P＜0.05具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化染色顯示 SP法免疫組化切片染色背景清晰，陰性對(duì)照無(wú)著色。Rac1陽(yáng)性反應(yīng)，主要存在于細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，呈棕黃色顆粒。Cdc42陽(yáng)性反應(yīng)主要存在于細(xì)胞漿，呈棕黃色，見(jiàn)圖1。

2.2 102例鼻咽癌中，Rac1陽(yáng)性表達(dá)86例（84%），染色呈棕褐色彌漫性分布。陰性表達(dá)16例（16%），28例（27%）弱陽(yáng)性表達(dá)，58例（57%）強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。而Cdc42陽(yáng)性表達(dá)83例（81%），染色呈棕褐色彌漫性分布。陰性表達(dá)19例（19%），25例（25%）弱陽(yáng)性表達(dá)，58例（57%）強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，見(jiàn)表1、2，圖1。

圖1 Rac1和Cdc42在鼻咽癌組織及鼻咽部正常上皮組織中中的表達(dá)

表1 鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中Rac1的表達(dá)

表2 鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中Cdc42的表達(dá)

2.3 分析發(fā)現(xiàn)Rac1和Cdc42表達(dá)鼻咽癌與對(duì)照組相比有顯著差異，對(duì)照組Rac1和Cdc42表達(dá)均顯著低于鼻咽癌組，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.004；P＝0.016）。

2.4 鼻咽癌中Rac1和Cdc42表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 表3結(jié)合患者的臨床資料，反映Racl和Cdc42表達(dá)率的臨床意義。我們看到Rac1和Cdc42表達(dá)率與患者的年齡、性別均無(wú)關(guān)，而在分化程度、浸潤(rùn)深度和TNM分期等臨床病理指標(biāo)之間的差異比較則顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義非常顯著。

表3 鼻咽癌中Rac1和Cdc42表達(dá)與臨床病理的關(guān)系

2.5 鼻咽癌Racl和Cdc42表達(dá)水平與臨床TNM分期的關(guān)系 TNM分期是臨床指示腫瘤嚴(yán)重程度的量化指標(biāo)。分析Racl和Cdc42陽(yáng)性表達(dá)的癌組織不同TNM分期的Rac1和Cdc42表達(dá)水平，可以發(fā)現(xiàn)Rac1和Cdc42表達(dá)水平在各分期之間存在明顯的差異，見(jiàn)表4、5。

表4 鼻咽癌組織中Rac1的表達(dá)水平與TNM分期的關(guān)系

2.6 鼻咽癌組織中Rac1和Cdc42表達(dá)的相關(guān)性為了進(jìn)一步分析鼻咽癌組織中Rac1和Cdc42表達(dá)的關(guān)系，我們將免疫組化的數(shù)據(jù)進(jìn)行了Spearson相關(guān)分析。分析其在鼻咽癌組織中的表達(dá)強(qiáng)度的關(guān)系，我們觀察到Rac1和Cdc42之間存在相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），見(jiàn)表6。

2.7 經(jīng)Kaplan－Meier計(jì)算總生存率平均為61.9±23.0，平均隨訪時(shí)間為60個(gè)月。病人的隨訪時(shí)間為12－87個(gè)月。102例患者中30例患者死于鼻咽癌。其生存時(shí)間的范圍是3－67個(gè)月。在圖2（a－d）中可以看到經(jīng)Kaplan－Meier計(jì)算的Rac1和Cdc42的生存率曲線。在Rac1低表達(dá)組和高表達(dá)組中，其5年總生存率和無(wú)瘤生存率分別為88.64% 和86.36比44.83和34.48%。（χ2＝27.236，P＜0.001；χ2＝28.836，P＜0.001）。但是，Cdc42 低 表達(dá)組 和Cdc42高表達(dá)組，5年生存率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.822，P＝0.364）。在這兩組中，無(wú)瘤生存率的差異也同樣無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝0.289，P＝0.591）。

表5 鼻咽癌組織中Cdc42的表達(dá)水平與TNM分期的關(guān)系

表6 鼻咽癌組織中Cdc42和Rac1表達(dá)的關(guān)系

圖2 Kaplan－Meier計(jì)算的Rac1和Cdc42的生存率曲線

3 討論

近年來(lái)的研究結(jié)果顯示Rac1在人類的正常組織中呈現(xiàn)低水平表達(dá)或不表達(dá)，但在卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種惡性腫瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)增高，而且Rac1的高表達(dá)同腫瘤細(xì)胞的分化程度、病理分型、TNM 分 期等表 型密切 相關(guān)[3－9]。以往有關(guān)Cdc42同惡性腫瘤的相關(guān)性研究有以下幾個(gè)方面，Cdc42在肺部腺癌中的表達(dá)明顯高于腺瘤，提示其可能與肺部腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[10]。Hirsch等報(bào)道Cdc42的負(fù)顯性突變體同大鼠乳腺癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。在2002年的Oncogene中，Meriane等指出Cdc42和Rac1與平滑肌肉瘤的惡性表型密切相關(guān)[12]。

本論文以免疫組化SP法檢測(cè)鼻咽癌組織和鼻咽部正常上皮組織中Racl和Cdc42的表達(dá)，證明在不同組織中Racl和Cdc42表達(dá)不同：鼻咽癌組織中Racl和Cdc42表達(dá)陽(yáng)性率為84%和81%，而鼻咽部正常上皮組織表達(dá)陽(yáng)性率為25%和35%。癌組織Racl和Cdc42的陽(yáng)性率遠(yuǎn)高于鼻咽部正常上皮組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在臨床TNM分期上Racl和Cdc42表達(dá)不同：TNM分期越高，則Racl和Cdc42表達(dá)率也越高。從病理角度看：分化程度的相關(guān)性最大，低分化癌陽(yáng)性率高達(dá)91.1%和87.8%，而高中度分化患者陽(yáng)性率只有33.3%，兩組之間的差異非常明顯?？梢?jiàn)，Racl和Cdc42的表達(dá)與鼻咽癌病情密切相關(guān)：病情越重、分化程度越低，Racl和Cdc42表達(dá)率越高。

一般認(rèn)為，鼻咽癌的預(yù)后與病理類型、TNM分期等因素相關(guān)。但我們?cè)谂R床中常常見(jiàn)到相同分期的病人卻有種截然不同的預(yù)后病程。近年來(lái)一些實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，有些分子標(biāo)志物也被證實(shí)為有意義的預(yù)后預(yù)測(cè)因子，這些因子有些已被作為預(yù)后判斷的指標(biāo)，與治療方案結(jié)合，作為輔助治療的選擇依據(jù)。

關(guān)于鼻咽癌的預(yù)后的分子標(biāo)志物的研究近年來(lái)成為熱點(diǎn)，其中血漿EBV－DNA水平的相關(guān)研究較多，但目前大規(guī)模人群篩查指標(biāo)的研究目前還難以推廣。本研究通過(guò)多因素分析，發(fā)現(xiàn)腫瘤的臨床分期與鼻咽癌患者預(yù)后有顯著相關(guān)性，是影響患者總體生存率和無(wú)瘤生存率的獨(dú)立因素。目前對(duì)鼻咽癌腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的研究尚處于探索性階段，鼻咽癌的生物標(biāo)志物檢查將幫助我們進(jìn)一步從分子生物學(xué)的角度觀察和解釋癌的臨床轉(zhuǎn)歸。然而，如何有機(jī)地綜合這些信息，對(duì)個(gè)體進(jìn)行準(zhǔn)確的預(yù)后預(yù)測(cè)，指導(dǎo)個(gè)體化治療方案的選擇，并最終改善預(yù)后，還需進(jìn)行更深入的研究和長(zhǎng)期的努力。

[1]Itoh RE，Kurokawa K，Ohba Y，et al.Activation of Rac and Cdc42 video imaged by fluorescent resonance energy transfer－based single－molecule probes in the membrane of living cells[J].Molecular and Cellular Biology，2002，22：6582.

[2]陳豐霖，王小眾，李建英，等.胃癌組織中cox－2與 NF－KB的表達(dá)及關(guān)系[J].臨床消化病雜志，2003，15：109.

[3]Minard ME，Kim LS，Price JE，et al.The role of the guanine nucleotide exchange factor Tiam1in cellular migration，invasion，adhesion and tumor progression[J].Breast Cancer Res Treat，2004，84：21.

[4]Fleming IN，Batty IH，Prescott AR，et al.Inositol phospholipids regulate the guanine－nucleotide－exchange factor Tiam1by facilitating its binding to the plasma membrane and regulating GDP／GTP exchange on Rac1[J].Bio Chem J，2004，382：857.

[5]Achiwa H，Lazo JS.PRL－1tyrosine phosphatase regulates c－Src levels，adherence，and invasion in human lung cancer cells[J].Cancer Research，2007，67：643.

[6]Owen D，Lowe PN，Nietlispach D，et al.Molecular dissection of the interaction between the small G proteins Rac1and RhoA and protein kinase C－related kinase 1（PRK1）[J].Journal of Biological Chemistry，2003，278：50578.

[7]Engers R，Springer E，Michiels F，et al.Rac affects invasion of human renal cell carcinomas by up－regulating tissue inhibitor of met－alloproteinases（TIMP）－1and TIMP－2expression[J].Journal of Biological Chemistry ，2001，276：41889.

[8]Malliri A，Collard JG.Role of Rho－family proteins in cell adhesion and cancer[J].Curr Opin Cell Biol，2003，15：583.

[9]Fritz G，Brachetti C，Bahlmann F，et al.Rho GTPases in human breast tumours：expression and mutation analyses and correlation with clinical parameters[J].Brit J Cancer，2002，87：635.

[10]Yao RS，Wang Y，Lubet RA，et al.Differentially expressed genes associated with mouse lung tumor progression[J].Oncogene，2002，21：5814.

[11]Hirsch DS，Shen Y，Wu WJ.Growth and motility inhibition of breast cancer cells by epidermal growth factor receptor degradation is correlated with inactivation of Cdc42[J].Cancer Research，2006，66：3523.

[12]Meriane M，Charrasse S，Comunale F，et al.Participation of small GTPases Rac1and Cdc42Hs in myoblast transformation[J].Oncogene，2002，21：2901.