孟秀香，劉丹丹，聶慧玲，劉純青，劉 奔，趙寶霞，趙心宇，楊 紅

（1.遼寧師范大學(xué) 生命科學(xué)院，遼寧 大連116081；2.大連醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連116044；3.大連市第五人民醫(yī)院 病理科，遼寧 大連116021）

非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）約占全部肺癌的85%，一般將其分為三個主要組織亞型：即鱗癌、腺癌（lung adenocarcinoma）和大細(xì)胞癌。肺腺癌與吸煙關(guān)系不大，其局部浸潤和血行轉(zhuǎn)移較鱗癌早。肺腺癌極易侵襲、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)是臨床治療的難點(diǎn)。盡管關(guān)于肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制的知識積累在快速增加，但我們對肺腺癌發(fā)生發(fā)展確切機(jī)制的了解仍較為 貧乏。Bmi－1 （B cell－specific Moloney murine leukemia virus insertion site 1）基因最初作為原癌基因由荷蘭癌癥中心于1991發(fā)現(xiàn)的［1］，Bmi－1與cmyc基因協(xié)同使得B細(xì)胞發(fā)生改變從而導(dǎo)致鼠淋巴瘤［2］。Bmi－1基因在人類很多常見的惡性腫瘤中都存在高表達(dá)［3－6］，并與腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有關(guān)Bmi－1在肺癌中的表達(dá)已有報道，非小細(xì)胞肺癌中Bmi－1表達(dá)較正常肺組織明顯增高［7］。Bmi－1在肺癌晚期（Ⅲ＋Ⅳ期）較肺癌早期（Ⅰ＋Ⅱ期）表達(dá)明顯增加［8］，這說明Bmi－1參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制。本實驗應(yīng)用免疫組織化學(xué)法（S－P法）檢測肺腺癌患者中癌組織及癌旁組織中Bmi－1和MMP－2蛋白的表達(dá)水平，分析兩者與臨床病理特征的關(guān)系及兩者之間的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1 臨床資料 肺癌組織標(biāo)本來自大連市第五人民醫(yī)院，選取大連市2009－2010年診斷明確、資料完整的手術(shù)切除肺部癌組織標(biāo)本38例，同時選取相應(yīng)的癌旁組織標(biāo)本35例作為對照。所有病例資料完整。上述38例肺癌組織臨床病理特征如下：性別：男18例、女20例；年齡41－79歲，平均64歲；TNM分期：Ⅰ期17例，Ⅱ期8例，Ⅲ期12例，Ⅳ期1例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。所有病例術(shù)前均未接受放、化療，術(shù)后均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診。

1.2 試劑及儀器 Bmi－1一抗購自Abcam公司；MMP－2一抗購自CST公司；二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 方法 標(biāo)本經(jīng)10%的中性福爾馬林固定后石蠟包埋，常規(guī)制片，采用免疫組織化學(xué)S－P法進(jìn)行染色。具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定 Bmi－1表達(dá)在癌細(xì)胞核中，MMP－2蛋白表達(dá)于細(xì)胞漿中，細(xì)胞核或漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。高倍顯微鏡下（×400）觀察，按陽性細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)的百分比計分：≤10%為1分，＞10%且≤50%為2分，＞50%且≤75%為3分，＞75%為4分；同時根據(jù)染色的強(qiáng)弱來計分：陰性或弱染色者1分，中等強(qiáng)度染色2分，強(qiáng)染色3分，根據(jù)二者的乘積來判斷結(jié)果：≤8分為低表達(dá)，＞8分為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件分析數(shù)據(jù)。所有統(tǒng)計均選取χ2檢驗，P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 Bmi－1在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá) Bmi－1呈胞核表達(dá)，細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示，在38例肺腺癌組織中Bmi－1陽性高表達(dá)明顯高于癌旁組織，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表1）。

表1 肺腺癌組織及癌旁組織中Bmi－1的表達(dá)情況

2.2 MMP－2在肺腺癌及癌旁組織中的表達(dá)MMP－2呈胞漿表達(dá)，細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示，在38例肺腺癌組織中MMP－2在癌組織中的陽性高表達(dá)明顯高于癌旁組織，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，表2）。

表2 肺腺癌組織及癌旁組織中MMP－2的表達(dá)情況

2.3 Bmi－1／MMP－2蛋白的表達(dá)與肺腺癌分期和轉(zhuǎn)移的關(guān)系χ2檢驗結(jié)果顯示，肺腺癌組織中Bmi－1的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)，而與患者的性別、年齡、病理類型、腫瘤體積大小無關(guān)。TNM分期高的組織（Ⅲ－Ⅳ期）中Bmi－1高表達(dá)率為92%（12／13），較分期低的組織（Ⅰ－Ⅱ期）明顯增加（60%，15／25），統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P＜0.05）。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中Bmi－1高表達(dá)率為94%（17／18）較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者明顯增加（50%，10／20），統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P＜0.01）。38例癌組織中 MMP－2的表達(dá)和淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與年齡、性別、瘤塊大小、TNM分期均無相關(guān)性。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的組織中，MMP－2高表達(dá)率為38.9%（7／18），明顯高于沒有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10%（2／20），統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P＜0.05）。同時Spearman相關(guān)性分析顯示，Bmi－1與 MMP－2表達(dá)呈正相關(guān)（P＜0.05）。

3 討論

在本研究中Bmi－1在肺腺癌中表達(dá)明顯增加，38例肺腺癌癌組織中Bmi－1表達(dá)水平明顯高于癌旁組織，這與其他文獻(xiàn)報道一致：Vonlanthen等［9］對48例NSCLC組織進(jìn)行了Bmi－1蛋白檢測，和癌旁組織相比明顯增高。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，Bmi－1和許多腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移、預(yù)后也密切相關(guān)。Huang等［10］對胃癌患者進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)癌組織Bmi－1表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，并且Bmi－1的表達(dá)水平和胃癌瘤塊的大小及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均呈現(xiàn)正相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)Bmi－1陽性表達(dá)者的生存時間明顯低于陰性表達(dá)者胃癌病例；馮艷等［11］的研究表明：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌中Bmi－1的表達(dá)高于無轉(zhuǎn)移的病例，與乳腺癌的病程具有正相關(guān)性。Zhang等［12］對134例肺癌標(biāo)本進(jìn)行了Bmi－1分析，74例病人Bmi－1表達(dá)呈陽性，并且Ⅲ期肺癌患者Bmi－1表達(dá)高于Ⅰ和Ⅱ期者。為了證實Bmi－1是否介入了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程，我們進(jìn)一步分析了Bmi－1與肺腺癌患者各臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果表明：Bmi－1的表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，而與其他特征不相關(guān)。推測原癌基因Bmi－1可能介入了肺腺癌的病理過程。類似的結(jié)果在其他腫瘤研究中也得到了體現(xiàn)：黃開紅等［13］的研究結(jié)果表明：Bmi－1在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)的癌旁組織，并且Bmi－1的表達(dá)水平與胃癌患者瘤塊的大小及淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移均呈正相關(guān)，同時Bmi－1陽性表達(dá)者的生存時間明顯低于陰性表達(dá)者；Song等［14］研究結(jié)果顯示：Bmi－1基因呈陽性表達(dá)的鼻咽癌患者，5年期生存率要明顯低于Bmi－1表達(dá)陰性的鼻咽癌病人。

導(dǎo)致惡性腫瘤治療失敗和致死的主要原因之一是腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。近年來對惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究正日趨深入。Liotta［15］提出侵襲轉(zhuǎn)移三步學(xué)說：即黏附、降解和移動。其基本過程是腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）和血管基底膜的降解和破壞。因此ECM和血管基底膜的降解、破壞是腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的重要步驟，而組成ECM和基底膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白為Ⅳ型膠原，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases，MMPs）能夠降解細(xì)胞外幾乎全部的基質(zhì)成分，破壞基底膜，是腫瘤細(xì)胞浸潤周圍正常組織中的物質(zhì)基礎(chǔ)［16］。MMPs中的MMP－9和MMP－2是降解Ⅳ型膠原的主要酶，因此，MMP－9和MMP－2在腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中占有非常重要的地位［17］。已有多篇文章報道MMP－2與非小細(xì)胞肺癌的轉(zhuǎn)移關(guān)系密切［18］。說明 MMP－2參與了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。Suzuki等［19］發(fā)現(xiàn)在 NSCLC中的 MMP－2和 MMP－9均有高表達(dá)，且 MMP－2的表達(dá)明顯強(qiáng)于 MMP－9，故認(rèn)為 MMP－2在肺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮比 MMP－9更加重要的作用。因此本實驗檢測了MMP－2的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP－2的高表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，同時發(fā)現(xiàn)Bmi－1與MMP－2呈正相關(guān)性。進(jìn)一步證實了Bmi－1參與了肺腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。

總之，本研究結(jié)果表明Bmi－1和 MMP－2在肺腺癌組織中高表達(dá)并具有相關(guān)性，同時二者在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，說明Bmi－1與肺腺癌的侵襲密切相關(guān)。為人們探討肺腺癌的侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制提供了重要的參考價值。

［1］Van Lohuizen M，Verbeek S，Scheljen B，et al.Identification of cooperating oncogenes in Eμ－myc transgenic mice by provirus tagging［J］.Cell，1991，65（5）：737.

［2］Haupt Y，Alexander WS，Barri G，et al.Novel zinc finger gene implicated as myc collaborator by retrovirally accelerated lymphomagenesis in Eμ－myc transgenic mice［J］.Cell，1991，65（5）：753.

［3］Reinisch C，Kandutsch S，Uthman A，et al.BMI－1：aprotein expressed in stem cells，specialized cells and tumors of the gastrointestinal tract［J］.Histol Histopathol，2006，21（11）：1143.

［4］Kim JH，Yoon SY，Kim CN，et al.The Bmi－1oncoprotein is overexpressed in human colorectal cancer and correlates with the reduced p16INK4a／p14ARF proteins［J］.Cancer Lett，2004，203（2）：217.

［5］Kim JH，Yoon SY，Jeong SH，et al.Overpression of Bmi－1oncoprotein correlates with axillary lymph node metastases in invasive ductal breast cancer［J］.Breast，2004，13（5）：383.

［6］Zhang F，Sui L，Xin T，et al.Correlations of BMI－1expression and telomerase activity in ovarian cancer tissues［J］.Exp Oncol，2008，30（1）：70.

［7］戰(zhàn)懷兵，蔡曦光，吳鳳銘.Bmi－1和h TERT在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.臨床腫瘤學(xué)雜志，2009，14（1）：10.

［8］Vrzalikova K，Skarda J，Ehrmann J，et al.Prognostic value of Bmi－1oncoprotein expression in NSCLC patients：a tissue microarray study［J］.J Cancer Res Clin Oncol，2008，134（9）：1037.

［9］Vonlanthen S，Heighway J，Altematt HJ，et al.The Bmi－1oncoprote in is differentially expressed in non－small cell lung cancer and correlates with INK4A－ARF locus expression［J］.Br J Cancer，2001，84（10）：1372.

［10］Huang KH，Liu JH，Li XX，et al.Association of Bmi－1mRNA expression with diferen tiation，metastasis and prognosis of gastric carcinoma［J］.Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2007，27（7）：973.

［11］馮 艷，宋立兵，郭寶紅，等.Bmi－1在乳腺癌組織中的表達(dá)及意義［J］.癌癥，2007，26（2）：154.

［12］Zhang XY，Dong QG，Huang JS，et al.The expression of stem cell－related indicators as a prognostic factor in human lung adenocarcinoma［J］.J Surg Oncol.2010，102（7）：856.

［13］黃開紅，劉建化，李學(xué)先，等.Bmi－1在胃癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究［J］.中國腫瘤臨床，2007，34（17）：961－5.

［14］Song LB，Zeng MS，Liao WT，et al.Bmi－1is a novel molecular marker of nasopharyngeal carcinoma progression and immortalizes primary human nasopharyngeal epithelial cells［J］.Cancer Res，2006，66（12）：6225.

［15］Liotta LA，Stetler Stevenson WG.Tumor invasion and metastasis：an imbalance of positive and negative regulation［J］.Cancer Res，1991，51（18suppl）：5054s.

［16］Stetler－StevensonWG，Hewitt R，Corcoran M.Matrix metalloproteinases and tumor invasion：from correlation and causality to the clinic［J］.Semin Cancer Biol，1996，7（3）：147.

［17］Parsons SL，Watson SA，Brown PD，et al.Matrix metalloproteinases.Br J surg，1997，84（2）：160.

［18］Thomas P，Khokha R，Shepherd FA，et al.Differential expression of matrix metalloproteinases and their inhibitors in nonsmall cell lung cancer［J］.J Pathol，2000，190（2）：150.

［19］Suzuki M，Lizasa T，F(xiàn)ujisawa T，et al.Expression of matrixmetalloproteinases and tissue inhibitor of matrixmetalloproteinases in nonsmall cell lung cancer［J］.Invasion Metastasis，1998，18（3）：134.