劉海鵬，宋憶淑，邵 英，張 舵＊

（1.吉林大學(xué)第一醫(yī)院 整形外科，吉林 長(zhǎng)春130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 眼科，吉林 長(zhǎng)春130041）

隨著功能基因組學(xué)研究的深入，在活體動(dòng)物模型上驗(yàn)證基因的生理功能，有十分重要的意義?；铙w小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量及相關(guān)房水動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕⑹冀K是眼科領(lǐng)域最為困難的課題之一，測(cè)量分析小鼠眼房水靜態(tài)和動(dòng)態(tài)生理學(xué)特性，該項(xiàng)研究工作極具挑戰(zhàn)性，以往很少有人涉足，如能建立一種精確性高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好的小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)將可能為致盲率最高的眼科疾病青光眼的治療帶來(lái)希望［1］。為此，本研究中我們采用纖維玻璃管侵入方法，利用將液體的壓力變化經(jīng)傳感器在電子計(jì)算機(jī)中轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號(hào)的實(shí)驗(yàn)原理，成功建立了獨(dú)特的活體小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量模型和與之相匹配的測(cè)量精度檢驗(yàn)校正系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

顯微操作用玻璃管、硬硅膠管、眼科顯微手術(shù)器械、水柱壓力計(jì)；克他命（Ketamine）、甲苯噻嗪（Xylazine）、0.5%丙美卡因（Proparacaine）、垂直型玻璃拉管機(jī)（Model 700C，David Kopf Instruments）、水平顯微熱加工機(jī)（Microforge，Model MF900，Narishige Co.Japan）、旋轉(zhuǎn)式顯微磨光機(jī) （Model BV10，Sutter Instruments Co.）、手術(shù)顯微鏡（Zeiss）、壓力傳感器（MX860，Medex Inc.）、電腦檢測(cè)系統(tǒng)的硬件和軟件（Model MP100，Biopac）、玻璃顯微注射器（10μl，Hamilton）、自動(dòng)注射泵（Harvard Apparatus），4－軸顯微操作儀（Narishige）、電離子滲透儀、Z－軸掃描共聚焦顯微鏡（改裝）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

4種 CD1小鼠：wildtype；AQP1－／－；AQP4－／－；AQP1－／－＋AQP4－／－，每種10只，雌雄各半，年齡為4－6周（重量27－33克），由美國(guó)加州大學(xué)舊金山醫(yī)學(xué)院動(dòng)物室提供，用含有4%脂肪的標(biāo)準(zhǔn)鼠食，室內(nèi)燈光為12h光照／12h黑暗周期循環(huán)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程完全符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)用法規(guī)。

1.3 眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)的建立和調(diào)試

利用將液體的壓力變化經(jīng)傳感器在電子計(jì)算機(jī)中轉(zhuǎn)變成數(shù)字信號(hào)的實(shí)驗(yàn)原理，建立眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)，如圖1。該系統(tǒng)可選擇性連接一只玻璃顯微注射器，由自動(dòng)注射泵控制注入速度。測(cè)量系統(tǒng)的連接管各連接處緊密連接，確保無(wú)滲漏，細(xì)致檢查排出系統(tǒng)液體中的任何微小氣泡。驗(yàn)證測(cè)量系統(tǒng)無(wú)滲漏：向測(cè)量系統(tǒng)內(nèi)注入液體，使壓力升至60 cmH2O，停止注入液體，12h后壓力仍保持在60 cmH2O無(wú)下降，證明該測(cè)量系統(tǒng)無(wú)滲漏；驗(yàn)證測(cè)量系統(tǒng)的精確性：先常規(guī)校正電腦檢測(cè)系統(tǒng)，然后在大氣壓下，將顯微玻璃管尖置于水滴中，此時(shí)大氣壓力測(cè)量值為零，將管尖刺入與水柱壓力計(jì)相連的膠皮囊，可獲得水柱壓力值，計(jì)算機(jī)記錄的測(cè)量結(jié)果與水柱壓力計(jì)數(shù)值相同，當(dāng)水柱壓力改變時(shí)，微機(jī)記錄顯示出相同的改變，證明測(cè)量系統(tǒng)準(zhǔn)確無(wú)誤，如圖2。

1.4 實(shí)驗(yàn)小鼠準(zhǔn)備

小鼠首先用克他命（100mg／kg）和甲苯噻嗪（9 mg／kg）混合腹腔內(nèi)注射麻醉。角膜用0.5%丙美卡因（Proparacaine）滴眼表面麻醉。麻醉生效后，將小鼠固定于立體固定器，并置于加熱墊上。用肛門(mén)體溫探測(cè)器測(cè)量體溫，使小鼠體溫維持在37±1℃。鼠眼暴露于手術(shù)顯微鏡下，間斷點(diǎn)滴生理鹽水預(yù)防角膜干燥，如圖3。

1.5 眼內(nèi)壓模型的建立

在小鼠角膜上滴一滴生理鹽水，調(diào)節(jié)4－軸顯微操作儀，使顯微玻璃管與眼球垂直軸成45－60°角，當(dāng)管尖進(jìn)入角膜表面鹽水中時(shí)，計(jì)算機(jī)開(kāi)始測(cè)量記錄，將此時(shí)測(cè)量的大氣壓力設(shè)定為0cmH2O。在40倍手術(shù)顯微鏡下，左手持小鑷子輕輕固定眼球中后部，右手調(diào)節(jié)顯微控制器，在位于角膜正中央外側(cè)約0.2mm處，用玻璃管尖快速刺穿角膜，控制管尖恰好位于前房間隙中，不能觸及晶體囊膜及虹膜。將最初10－30秒鐘內(nèi)眼內(nèi)壓記錄的平均值，視為該鼠的生理眼內(nèi)壓的數(shù)值。測(cè)量過(guò)程中保持角膜上的液滴，預(yù)防角膜干燥。

1.6 觀(guān)察指標(biāo) ①小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)精確性驗(yàn)證：（1）為確認(rèn)管尖無(wú)阻塞并測(cè)量到前房的真實(shí)壓力，在實(shí)驗(yàn)中將第2支顯微玻璃管同時(shí)刺入前房中，并同一個(gè)水壓力計(jì)相連，如（圖1，左側(cè)灰線(xiàn)部分），用來(lái)驗(yàn)證是否測(cè)量到前房的真正壓力，當(dāng)改變水壓力計(jì)設(shè)定的壓力時(shí)，計(jì)算機(jī)可精確記錄到相應(yīng)變化。（2）連續(xù)測(cè)量眼內(nèi)壓30min以上，獲得穩(wěn)定眼內(nèi)壓，證明測(cè)量系統(tǒng)精確穩(wěn)定無(wú)滲漏。（3）分別測(cè)量同一只小鼠雙眼的眼內(nèi)壓，雙眼檢測(cè)結(jié)果相符，進(jìn)一步證明測(cè)量系統(tǒng)是可靠的。②利用建立的眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)測(cè)量40只不同基因型小鼠的眼內(nèi)壓。

圖1 眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)工作原理示意圖

圖2 小鼠眼房水動(dòng)力學(xué)檢測(cè)系統(tǒng)精確性校正

圖3 小鼠眼房水動(dòng)力學(xué)測(cè)量 顯微操作

2 結(jié)果

2.1 小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)精確性評(píng)價(jià)

為確認(rèn)管尖無(wú)阻塞并測(cè)量到前房的真實(shí)壓力，第2支顯微玻璃管同時(shí)刺入前房中，并同一個(gè)水壓力計(jì)相連，先將壓力計(jì)壓力定為0cmH2O，后每間隔一分鐘左右，調(diào)節(jié)壓力計(jì)依次升高5cmH2O，壓力依次改變?yōu)?－5－10－15－20－25－30 cmH2O；再調(diào)節(jié)壓力計(jì)依次下降5cmH2O，壓力依次改變?yōu)椋?0－25－20－15－10－5－0cmH2O。此時(shí)測(cè)量系統(tǒng)可精確記錄到相應(yīng)壓力變化，證明測(cè)量系統(tǒng)的精確和可信，如圖4。連續(xù)測(cè)量眼內(nèi)壓30 min以上，獲得穩(wěn)定眼內(nèi)壓，證明測(cè)量系統(tǒng)精確穩(wěn)定無(wú)滲漏，如圖5。分別測(cè)量同一只小鼠雙眼的眼內(nèi)壓，雙眼檢測(cè)結(jié)果相符，進(jìn)一步證明測(cè)量系統(tǒng)是可靠的，如圖6。

2.2 小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量結(jié)果

在實(shí)驗(yàn)中連續(xù)記錄了40只小鼠眼內(nèi)壓的生理曲線(xiàn)，曲線(xiàn)平穩(wěn)不變，如圖7。

圖4 驗(yàn)證測(cè)量系統(tǒng)精確性壓力曲線(xiàn)

圖5 小鼠眼內(nèi)壓連續(xù)測(cè)量記錄穩(wěn)定性曲線(xiàn)

圖6 小鼠雙眼眼內(nèi)壓測(cè)量 曲線(xiàn)

圖7 CD1（wildtype；AQP1－／－；AQP4－／－；AQP1－／－＋AQP4－／－）小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量曲線(xiàn)

3 討論

目前，世界上關(guān)于小鼠眼生理指標(biāo)和特性的研究資料甚少，最主要原因是動(dòng)物模型建立難度大、精度要求高。小鼠眼生理測(cè)量系統(tǒng)的建立和調(diào)試過(guò)程是艱難和復(fù)雜的，手工操作步驟及其影響因素過(guò)多，存在著諸多系統(tǒng)誤差和人為誤差。這也給活體小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量及相關(guān)房水動(dòng)力學(xué)研究帶來(lái)了很大困難。

以往世界上僅有3個(gè)實(shí)驗(yàn)室能夠測(cè)量到小鼠眼內(nèi)壓，然而這3個(gè)實(shí)驗(yàn)室所采用的測(cè)量方法完全不同，因此獲得的數(shù)據(jù)自然也缺少可信性［2－3］。Jone等人的方法最初所測(cè)得的小鼠眼內(nèi)壓數(shù)值偏低［4－9］，且前后波動(dòng)過(guò)大。Cohan等人的非入侵法，測(cè)得的眼內(nèi)壓值也相對(duì)較低，誤差較大。Avila［10］等提出的SNMS方法，雖然測(cè)量到與其它方法相比相對(duì)較高，看似相對(duì)合理的眼內(nèi)壓值，但這可能與單獨(dú)用克他命麻醉劑使眼內(nèi)壓升高有關(guān)。

本研究中，我們以醫(yī)學(xué)和生物物理學(xué)的理論為依據(jù)，憑借多年積累的顯微操作實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，精心設(shè)計(jì)并建立了獨(dú)特的小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量系統(tǒng)和與之匹配的測(cè)量精度檢驗(yàn)校正系統(tǒng)。我們著重解決了實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中所涉及的各種影響因素，通過(guò)將50μm的玻璃管尖刺入前房中，能記錄到瞬時(shí)眼內(nèi)壓的變化情況；能在無(wú)房水滲漏的情況下，連續(xù)測(cè)量30分鐘以上眼內(nèi)壓的動(dòng)態(tài)變化；并能將液體注入房水間隙，同時(shí)測(cè)量房水排出、房水間隙的順應(yīng)性等其它重要眼生理學(xué)指標(biāo)，因此是一種精確、穩(wěn)定的多功能小鼠眼內(nèi)壓測(cè)量方法。

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