華映坤，曾 蓉，撒亞蓮，趙仁彬，鄒云蓮，陸 潔，嚴(yán)新民，史克倩，沈曉梅

（云南省第一人民醫(yī)院 臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 血液科，云南 昆明650032）

B細(xì)胞淋巴瘤（B lymphoma）是源于濾泡生發(fā)中心的惡性腫瘤，復(fù)發(fā)及耐藥是治療失敗的主要原因，尋找有效的診治方法是當(dāng)前的主要任務(wù)［1］。

建立荷瘤鼠模型對(duì)探討腫瘤的病因、發(fā)病機(jī)制及制定診治策略具有重要價(jià)值［2，3］。有學(xué)者已建立淋巴瘤模型［4，5］，為客觀評(píng)估本實(shí)驗(yàn)室后續(xù)的研究結(jié)果，需建立自己的疾病模型數(shù)據(jù)。目前尚無(wú)SCID小鼠腹腔Namalwa細(xì)胞株－人B細(xì)胞淋巴瘤模型的報(bào)道。本研究通過(guò)在SCID小鼠腹腔接種Namalwa細(xì)胞，探索建立人B細(xì)胞淋巴瘤模型的條件及其腫瘤生長(zhǎng)特性，觀察荷瘤鼠的發(fā)病情況和生存時(shí)間，為研究B細(xì)胞淋巴瘤提供載體信息及搭建技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 Namalwa細(xì)胞株為本研究所凍存。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SCID小鼠16只，雌性、雄性各半，4－5周齡，體重16－20g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)均在昆明醫(yī)學(xué)院云南省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的SPF動(dòng)物層流室內(nèi)進(jìn)行。

1.1.3 試劑和耗材 RPMI－1640購(gòu)自 TakaRa公司。小牛血清購(gòu)自Hyclone公司。免疫組織化學(xué)試劑購(gòu)自福建邁新生物技術(shù)公司（一抗為鼠抗人的單克隆抗體）。流式標(biāo)記CD19抗體購(gòu)自BD公司。石蠟包埋切片及HE染色所用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純，塑料培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板均為Corning公司產(chǎn)品。

1.1.4 儀器 CO2培養(yǎng)箱（Forma Therapeutics Inc.，USA）；倒置顯微鏡（Nikon，Japan）；Shuang Lu冰箱 （BCD－230）；國(guó)產(chǎn)低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（LDZ 5－2）；流式細(xì)胞儀（Beckman－coulter EPICSXL，Immuno－Trul，USA）；SW－CJ－1F標(biāo)準(zhǔn)型型凈化工作臺(tái)（吳江市綠島凈化設(shè)備廠）；普通光學(xué)顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 Namalwa細(xì)胞系的培養(yǎng)及鑒定 迅速?gòu)囊旱奕〕鯪amalwa細(xì)胞凍存管，放入38℃水浴中，不停搖動(dòng)，使其快速融化，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含培養(yǎng)液的離心管中，500g離心5min，棄上清，用含15%小牛血清（滅活補(bǔ)體）的RPMI－1640培養(yǎng)液重懸Namalwa細(xì)胞，置37℃，50ml／L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。收集1×106細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞膜表面分子CD19的表達(dá)。

1.2.2 人B細(xì)胞淋巴瘤SCID小鼠腹腔模型的建立 離心收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Namalwa細(xì)胞，用生理鹽水懸浮細(xì)胞，每只小鼠經(jīng)腹腔接種7.5×106個(gè)細(xì)胞（0.5ml）。

1.2.3 荷瘤鼠的發(fā)病情況及其臟器累及情況 觀察荷瘤鼠的毛發(fā)、活動(dòng)狀態(tài)及腫瘤的生長(zhǎng)情況。待荷瘤鼠自然死亡或?yàn)l死時(shí)處死并解剖觀察臟器浸潤(rùn)情況，將瘤塊及侵犯的臟器：肝、脾、胰、腎、肺、胃、腸、盆腔臟器、鄰近的肌肉和皮膚等器官進(jìn)行病理檢查。

1.2.4 病理形態(tài)學(xué)檢查 常規(guī)4μm厚的石蠟切片和HE染色法。

1.2.5 免疫組化 用MaxvisionTM 2試劑盒檢測(cè)CD79a，CD20，Ki－67和 CD3在瘤組織中的表達(dá)，DAB顯色。結(jié)果判斷：CD79a，CD20和CD3以胞膜著色為陽(yáng)性，Ki－67以胞核著色為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

2.1 Namalwa細(xì)胞形態(tài)及CD19的表達(dá)

Namalwa細(xì)胞體積中等，圓形，折光性強(qiáng)，以細(xì)胞克隆團(tuán)和散在單個(gè)細(xì)胞相間存在；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞膜表面表達(dá)CD19的陽(yáng)性率為98.8%（圖1）。

圖1 Namalwa細(xì)胞的鏡下形態(tài)及細(xì)胞膜表型

2.2 人B細(xì)胞淋巴瘤SCID小鼠腹腔模型的建立

16只SCID小鼠有14只成瘤，成瘤率87.5%，中位成瘤時(shí)間為（18.67±1.94）d，中位生存期為（28.00±6.36）d。腹腔接種Namalwa細(xì)胞株后5－7d，SCID小鼠頭頂部出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、行動(dòng)遲緩，活動(dòng)減少，腹部包塊，后期出現(xiàn)腫塊處皮膚破潰，所在側(cè)的后肢行走困難。一般情況隨荷瘤時(shí)間的延長(zhǎng)不斷惡化。腫塊大小為（1.5－3.0）cm×（0.5－1.5）cm（圖2）。

2.3 病理學(xué)觀察

荷瘤鼠腹部瘤塊多為圓形或橢圓形結(jié)節(jié)，局部有壞死，邊界尚清楚，有黏連。瘤體剖面呈灰白色，質(zhì)細(xì)柔，魚(yú)肉狀，易碎。瘤細(xì)胞密集排列、均勻一致（部分標(biāo)本瘤細(xì)胞相互粘連成片），呈現(xiàn)異型，間質(zhì)極少。瘤細(xì)胞體積中等，胞漿少。胞核中等大，染色質(zhì)較細(xì)致（有泡狀），核仁較小，一個(gè)至數(shù)個(gè)，嗜堿性，核分裂活躍。許多瘤細(xì)胞發(fā)生碎屑性壞死。在腸、胃、肝、脾、腎、肺、胰、盆腔及鄰近肌肉和皮膚有瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，肝臟出現(xiàn)變性及局灶壞死（圖3）。

圖2 荷瘤的SCID小鼠和瘤組織

圖3 瘤組織及瘤細(xì)胞浸潤(rùn)各組織的HE染色情況

2.4 瘤組織的免疫組織化學(xué)結(jié)果判斷

CD79a在胞膜和Ki－67在胞核有彌漫的棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)（圖4－A，B）。CD20在胞膜有散在的棕黃色的陽(yáng)性物質(zhì)（圖4－C）；CD3染色未見(jiàn)棕黃色的陽(yáng)性物質(zhì)（圖4－D）。陰性對(duì)照未見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性物質(zhì)。

3 討論

制備小鼠腫瘤模型可選用免疫功能健全的小白鼠、細(xì)胞免疫功能缺陷的裸鼠及細(xì)胞免疫－體液免疫聯(lián)合缺陷的SCID小鼠等［6］，本研究考慮到后續(xù)開(kāi)展細(xì)胞過(guò)繼免疫治療的研究，為避免荷瘤鼠自身免疫的干擾，我們選用SCID小鼠制備淋巴瘤模型。瘤細(xì)胞常接種在皮下、腹腔或經(jīng)血液播散成瘤。瘤體生長(zhǎng)在皮下便于觀察，但Hoyle等報(bào)道，淋巴瘤細(xì)胞株在小鼠皮下較難成瘤，需用Matrigel聯(lián)合移植［7，8］。另外，淋巴瘤常在血管外以腫塊為首發(fā)癥狀來(lái)就診。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用腹腔內(nèi)成瘤。我們將7.5×106個(gè)Namalwa細(xì)胞經(jīng)SCID小鼠腹腔接種后 （18.67±1.94）d，在腹腔出現(xiàn)包塊，經(jīng)病理觀察及免疫組化檢測(cè)B細(xì)胞淋巴瘤特征性抗原的結(jié)果提示，接種Namalwa細(xì)胞在SCID小鼠腹腔可以成功建立人B細(xì)胞淋巴瘤模型。在我們的實(shí)驗(yàn)中，雌、雄各有一只SCID小鼠未成瘤，可能與SCID小鼠存在Leaky現(xiàn)象（即：滲漏，在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到淋巴樣細(xì)胞和免疫球蛋白）有關(guān)［9］。

圖4 免疫組化檢測(cè)淋巴瘤組織中的特征性標(biāo)記物

閆金松等將5×106及10×l06個(gè)Daudi細(xì)胞經(jīng)SCID小鼠尾靜脈移植建立淋巴瘤模型，觀察到2周時(shí)出現(xiàn)豎毛、精神萎靡等變化，出現(xiàn)雙下肢癱瘓的中位時(shí)間是30.5d（29－32d），存活時(shí)間是40d，而兩個(gè)細(xì)胞濃度的發(fā)病時(shí)間、發(fā)病情況沒(méi)有區(qū)別［5］。我們通過(guò)腹腔接種Namalwa細(xì)胞株后（5－7d）觀察到豎毛，而腹腔出現(xiàn)包塊的時(shí)間是（18.67±1.94）d，存活時(shí)間為（28.00±6.36）d。上述結(jié)果的不一致可能與接種瘤細(xì)胞的途徑及細(xì)胞株類型不同有關(guān)。

我們觀察到接種Namalwa細(xì)胞后，荷瘤鼠的瘤體生長(zhǎng)速度快，且累及多個(gè)臟器及組織，在肝、脾、胰、腎、肺、胃、腸、盆腔臟器、鄰近的肌肉和皮膚等有瘤細(xì)胞的廣泛浸潤(rùn)。Namalwa細(xì)胞株來(lái)自B細(xì)胞淋巴瘤患者。用免疫組化的方法檢測(cè)到瘤組織表達(dá)B細(xì)胞特征性標(biāo)記物CD79a為強(qiáng)陽(yáng)性，CD20為散在分布（與CD79a抗原表達(dá)譜較CD20廣有關(guān)），而T細(xì)胞標(biāo)記物CD3為陰性。Ki－67是 一種與細(xì)胞周期相關(guān)的蛋白質(zhì)，為細(xì)胞增殖及DNA合成所必需，是反映細(xì)胞增生活性的指標(biāo)。Ki－67在瘤組織中為彌漫陽(yáng)性，提示腫瘤細(xì)胞增生活躍［10，11］。我們的結(jié)果表明在SCID小鼠腹腔成功建立了Namalwa細(xì)胞源的人B細(xì)胞淋巴瘤模型，這為我們開(kāi)展后續(xù)研究提供載體。

致謝：感謝本院病理科陳天星主任醫(yī)師、楊慧主管技師、李英技師、楊宣濤副主任醫(yī)師、張會(huì)華主管技師的支持和幫助！

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