王 斌，劉玉俠，何春瑩，陳佳祺

（1.吉林省腫瘤醫(yī)院 腹外科，吉林 長(zhǎng)春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林 長(zhǎng)春130012）

腫瘤的治療除了傳統(tǒng)的手術(shù)、化療、放療外，近年來生物治療在腫瘤的治療中發(fā)揮著重要作用。由于生物治療對(duì)人體沒有毒副作用，對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有預(yù)防和治療作用，所以近年來在腫瘤治療領(lǐng)域得到了較廣泛的重視。本實(shí)驗(yàn)通過體外培養(yǎng)DC，CIK細(xì)胞并與人結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116共同培養(yǎng)，檢測(cè)兩種細(xì)胞對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116的體外殺傷效果，為結(jié)腸癌的生物治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以及理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料 淋巴細(xì)胞分離液（比重1.078）：中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院血研所科技公司；GM－CSF，TNF－α，IL－4，IL－1α：Peprotech 公司；IMDM培養(yǎng)基：GIBCO 公司；CD3單抗：RD公司；IL－2：北京四環(huán)生物公司；IFN－γ，上海凱茂生物醫(yī)藥有限公司；胎牛血清：天津TBD生物技術(shù)發(fā)展中心；MTT：Sigma公司。

1.2 結(jié)腸癌細(xì)胞株SW1116 購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院

1.3 方法

1.3.1 DC的誘導(dǎo)、培養(yǎng)、鑒定 參見文獻(xiàn)［1］。

1.3.2 CIK的誘導(dǎo)、培養(yǎng) 首先用淋巴細(xì)胞分離液分離人外周血單核細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)為1×106／ml，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，然后將培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞加入IFN－r 1 000U／ml，CD3Ab 100ng／ml，IL－1a1000U／ml，IL－2 1000 U／ml，每3天換液，同時(shí)補(bǔ)加IL－2。

1.3.3 CIK細(xì)胞表型的測(cè)定 將誘導(dǎo)培養(yǎng)的CIK細(xì)胞用FITC標(biāo)記的CD3Ab、PE標(biāo)記的CD16、CD56Ab標(biāo)記CIK細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3＋CD16＋CD56＋細(xì)胞的表達(dá)。

1.3.4 培養(yǎng)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116 將SW1116用含10%IMDM的培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用0.25%胰酶消化后離心洗滌，調(diào)細(xì)胞數(shù)為5×104／ml，接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。

1.3.5 SW1116抗原的提取方法 參見文獻(xiàn)［1］。

1.3.6 負(fù)載抗原的 DC（DCAg），CIK 對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116殺傷活性測(cè)定 將培養(yǎng)的DCAg，CIK調(diào)細(xì)胞數(shù)為2.5×106／ml，按以下設(shè)計(jì)加入到已接種SW1116的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)6復(fù)孔。

第1組 DCAg，第2組 CIK，第3組 DCAg＋SW1116，第4組CIK＋SW1116，第5組SW1116。將以上加入細(xì)胞的培養(yǎng)板放入37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束前4小時(shí)加入MTT，培養(yǎng)結(jié)束，吸去上清，加150μl DMSO，振蕩混勻，用酶標(biāo)儀在292nm處測(cè)OD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS V16.0軟件，采用t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果

2.1 CIK細(xì)胞表型測(cè)定結(jié)果 見圖1。從圖中可以看出CD3＋CD16＋CD56＋表達(dá)為74.3%，證明CIK的比例很高。

圖1 CIK細(xì)胞表型測(cè)定

2.2 DCAg，CIK對(duì)SW1116細(xì)胞殺傷活性，見表1。

表1 DCAg，CIK細(xì)胞對(duì)SW1116細(xì)胞殺傷活性

從以上結(jié)果可以看出，負(fù)載抗原的DC和CIK對(duì)SW1116均有較強(qiáng)的殺傷效果，兩者之間在統(tǒng)計(jì)學(xué)上沒有差別。

3 討論

結(jié)腸癌（colorectal cancer，CRC）是常見的消化道惡性腫瘤之一，它嚴(yán)重威脅著人類的健康。世界范圍內(nèi)結(jié)腸癌的發(fā)病率占所有惡性腫瘤的第3位，每年約有120萬例新增患者，其中40%－50%的患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已有轉(zhuǎn)移［2］，近80%的患者就診時(shí)已屬于晚期。病變發(fā)現(xiàn)早期進(jìn)行手術(shù)，患者5年生存率可以達(dá)到90%，而發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）患者5年生存率僅為10%［3］。結(jié)直腸癌引起的死亡也是全世界惡性腫瘤導(dǎo)致死亡的主要原因之一，目前，結(jié)腸癌在我國(guó)發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢(shì)［4］，而其常規(guī)的治療手段包括手術(shù)、化療、放療，這些方法雖然對(duì)結(jié)腸癌的治療起到很好效果，但是對(duì)一些微小轉(zhuǎn)移灶還不能達(dá)到徹底根除的目的。生物治療是近年來發(fā)展起來的有效治療腫瘤的一種方法，它對(duì)腫瘤的直接殺傷作用以及通過活化機(jī)體免疫功能主動(dòng)攻擊腫瘤作用，使其對(duì)腫瘤治療效果的提高發(fā)揮了獨(dú)特的效果，已成為腫瘤治療的又一種有效治療方法。

生物治療細(xì)胞有很多種，本實(shí)驗(yàn)選擇了DC和CIK針對(duì)結(jié)腸癌進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，以證明它們的抗結(jié)腸癌效果，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

DC是人體內(nèi)功能最強(qiáng)的，唯一能激活初始型T淋巴細(xì)胞的抗原遞呈細(xì)胞［5］，它能夠攝取、加工、遞呈抗原［6］，促進(jìn)CTL細(xì)胞和Th細(xì)胞的生成，啟動(dòng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗腫瘤作用。

CIK細(xì)胞又被稱為NK細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞，它同時(shí)表達(dá)CD3和CD56兩種膜蛋白分子，所以兼具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤優(yōu)點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)通過負(fù)載抗原的DC和CIK對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞SW1116的體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，DC和CIK對(duì)SW1116均具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，對(duì)其殺傷率分別達(dá)到64.10%和67.70%。根據(jù)它們不同的抗腫瘤特性，在臨床應(yīng)用時(shí)可以選擇聯(lián)合應(yīng)用，以達(dá)到最佳的抗腫瘤效果。

［1］劉玉俠，于 鴻，張振武，等.熱休克蛋白70激發(fā)樹突狀細(xì)胞抗肝癌作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2010，14（12）：1969.

［2］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global Cancer Statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69.

［3］Meyerhardt JA，Mayer RJ.Systemic therapy for colorectal cancer［J］.N Engl J Med，2005，352（5）：476.

［4］于世英.臨床腫瘤學(xué)［M］.北京：科學(xué)出版社，2006：197.

［5］Nair SK，Synder D，Rous BT，et al.Regression of tumors in mice vaccinated with professional antigen－pregenting cells pulsed with tumor extracts［J］.Int J Cancer，1997，70：706.

［6］Gilboa E.DC－based cancer vaccines［J］.J Chin Invest，2007，117：1195.