廖 琪，崔滿(mǎn)華

（1.大慶龍南醫(yī)院，黑龍江 大慶163453；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130041）

卵巢癌是威脅女性健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一［1］，由于發(fā)病隱匿，早期癥狀不明顯而致診斷困難，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已有廣泛的盆腹腔轉(zhuǎn)移。其病死率最高，且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。本研究以shRNA干擾DNA－PK和CHK1在卵巢癌Skov3細(xì)胞中的表達(dá)，觀察給予輻射后細(xì)胞凋亡變化情況，探討相關(guān)輻射損傷機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

Skov3細(xì)胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，青霉素100U／ml，鏈霉素100μg／ml，置于5%CO2培養(yǎng)箱中。轉(zhuǎn)染前一天，以3×105個(gè)細(xì)胞／孔接種于6孔培養(yǎng)板。

1.2 載體構(gòu)建和篩選

根據(jù)DNA－PK和CHK1基因構(gòu)建4個(gè)shRNA載體，并以無(wú)關(guān)序列 GTTCTCCGAACGTGTCACGT構(gòu)建對(duì)照載體shNC。經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶和測(cè)序鑒定，轉(zhuǎn)染Skov3細(xì)胞篩選出有效shRNA載體，其靶向序列分別是GGAATAGTACTTACTGCAATG、GCATTGGAATTATCTCAAAGC。將有效的shRNA載體以脂質(zhì)體Lipofectimines 2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，質(zhì)粒、脂質(zhì)體的比例為2μg∶5μl。

1.3 照射條件及流式檢測(cè)

轉(zhuǎn)染shRNA后20h，Skov3細(xì)胞接受X－射線(xiàn)照射。照射采用飛利浦深部X－線(xiàn)治療機(jī)，電壓200 kV，電流10mA，過(guò)濾器銅0.5mm，鋁1.0mm；劑量率0.287Gy／min，總量為2Gy。X－射線(xiàn)照射前用PBS洗細(xì)胞，加2ml PBS后進(jìn)行照射；照射后，立即更換新鮮的完全培養(yǎng)基，即轉(zhuǎn)染后24h或48h收集細(xì)胞，PBS洗3次，每次離心800rpm，5min。加AnnexinV／PI染色10min，PBS洗3次。應(yīng)用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀檢測(cè)、分析細(xì)胞凋亡，應(yīng)用Modifit軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS14軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

X 射線(xiàn)照射后4hr，轉(zhuǎn)染 DNA－PK shRNA－5297和CHK1shRNA－617的Skov3細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)為24.80%±3.20%，顯著高于單純轉(zhuǎn)染DNAPK shRNA－5297 ＋ CHK1shRNA－617 組 （t＝4.7365，P＝0.0008），顯著高于轉(zhuǎn)染shNC＋radiation組（t＝5.9663，P＝0.0001），顯著高于 Control組、shNC組、radiation組（t＝18.6358，t＝9.6229，t＝16.9786，P＜0.001）。X射線(xiàn)照射后28hr時(shí)，轉(zhuǎn)染 DNA－PK shRNA－5297和CHK1shRNA－617的Skov3細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)為18.91%±2.81%，顯著高于單純轉(zhuǎn)染 DNA－PK shRNA－5297 ＋CHK1shRNA－617組（t＝4.1306，P＝0.0020），明顯高于轉(zhuǎn)染shNC＋radiation組（t＝6.0371，P＝0.0001），顯著高于 Control組、shNC 組、radiation組（t＝15.9068，t＝9.7317，t＝15.5251，P＜0.001）。見(jiàn)表1。

表1 X射線(xiàn)照射對(duì)轉(zhuǎn)染DNA－PK shRNA－5297和CHK1 shRNA－617的Skov3細(xì)胞凋亡影響

3 討論

DNA損傷應(yīng)答（DNA damage response，DDR）是一個(gè)異常復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)，是細(xì)胞內(nèi)一種非常保守的抵御外界及內(nèi)在因素誘導(dǎo)的DNA損傷的機(jī)制，對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及治療具有重要的作用。

DNA 依賴(lài)的蛋白激酶（DNA－dependent protein kinase，DNA－PK）是完成非同源末端連接DNA雙鏈斷裂修復(fù)途徑的關(guān)鍵酶，同時(shí)參與DNA復(fù)制的調(diào)控、作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因的表達(dá)、維持染色體端粒結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定、參與細(xì)胞的凋亡等諸多作用。DNA－PK由兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基 Ku70、Ku80和一個(gè)DNA依賴(lài)的蛋白激酶催化亞單位（DNA－dependent protein kinase catalytic subunit，DNA－PKcs）組成。當(dāng)發(fā)生DNA雙鏈斷裂后，DNK－PKcs在Ser2056和Thr2609殘基自磷酸化后，離開(kāi)Ku而與γH2AX和53BP1共同結(jié)合在DNA雙鏈斷裂處［2］。Ku70和Ku80識(shí)別并結(jié)合于每一條DNA鏈斷端，Ku蛋白本身具有的解螺旋酶活性使兩個(gè)斷端局部發(fā)生解鏈，并可以保護(hù)游離的DNA末端避免被核酸酶分解，形成的Ku－DNA復(fù)合物吸引DNA－PKcs等到損傷部位完成結(jié)合并被激活，將兩個(gè)DNA斷端直接連接，完成修復(fù)后DNA－PK即發(fā)生自身磷酸化，DNA－PK復(fù)合體從DNA鏈上解離［3］。對(duì)于不能修復(fù)的DNA損傷或者端粒變短，DNA－PK可誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序［4］。

檢查點(diǎn)激酶1（checkpoint kinase，CHK1）是一種高度保守的絲氨酸／蘇氨酸蛋白質(zhì)激酶，是非常重要的細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶。CHK1基因位于染色體11q24，其cDNA全長(zhǎng)1891bp，編碼由476個(gè)氨基酸組成的蛋白，分子量54kD，其蛋白在多種組織均有表達(dá)，在胞漿和胞核均有表達(dá)，但主要在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用。CHK1的活性結(jié)構(gòu)域包括兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域：含有88個(gè)氨基酸殘基以β折疊構(gòu)成N端結(jié)構(gòu)域和210個(gè)氨基酸殘基以α螺旋結(jié)構(gòu)組成C端結(jié)構(gòu)域?；钚晕稽c(diǎn)位于這兩個(gè)亞結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)上［5］。DNA受損后活化CHK1，致使細(xì)胞阻滯在S期、G2／M期檢查點(diǎn)，使受損的DNA得以修復(fù)，從而維持基因組的完整性；若損傷廣泛而無(wú)法修復(fù)時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)凋亡。CHK1還參與染色質(zhì)和紡錘體裝配。有研究提示，多種腫瘤組織及細(xì)胞系中CHK1高表達(dá)，與腫瘤的耐藥及不良預(yù)后有關(guān)。

本研究提示DNA－PK和CHK1參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程，包括識(shí)別DNA損傷位點(diǎn)，啟動(dòng)修復(fù)程序，調(diào)控轉(zhuǎn)錄和凋亡。因此，應(yīng)用shRNA技術(shù)沉默Skov3細(xì)胞中DNA－PK和CHK1的表達(dá)，可以明顯提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)輻射的敏感性，不僅對(duì)相關(guān)輻射損傷機(jī)制進(jìn)行了初步探討還為卵巢癌的治療提供了新方向。

［1］Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010［J］.CA Cancer J Clin，2010，60（5）：277.

［2］Yang J，Yu Y，Hamrick HE，Duerksen－Hughes PJ.ATM，ATR and DNA－PK：initiators of the cellular genotoxic stress responses［J］.Carcinogenesis，2003，24（10）：1571.

［3］Collis SJ，DeWeeseTL，JeggoPA，etal.The life and death ofDNAPK［J］.Oncogene，2005，24（6）：949.

［4］Mi J，Dziegielewski J，Bolesta E，etal.Activation ofDNA－PK by ionizing radiation Is mediated by protein phosphatase 6［J］.Plos One，2009，4（2）：4395.

［5］Zhao B，Bower MJ，McDevitt PJ，et al.Structural basis for Chkl inhibition by UCN－01.J Biol Chem，2002，277（48）：46609－46615.