林 巍，李繼昌，蔣 紅，劉曉蘭

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾161006；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150030）

黏菌素（colistin）是由多黏芽孢桿菌培養(yǎng)液中獲得的堿性多肽類抗生素，對革蘭陰性桿菌有強烈的抑菌作用，臨床常用其硫酸鹽。黏菌素存在的5個游離氨基可與哺乳動物細胞膜上帶陰性電荷的磷脂結(jié)合，引發(fā)動物的毒副作用（包括神經(jīng)毒性和腎毒性）［1］。背根神經(jīng)節(jié)分散存在于外周神經(jīng)系統(tǒng)，定位于和脊髓緊密相連的脊神經(jīng)根上，DRG富含周圍神經(jīng)系統(tǒng)的感覺神經(jīng)元，是外周和中樞纖維聯(lián)系的一個重要中繼站，在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要作用，是研究黏菌素神經(jīng)毒性機制理想的神經(jīng)元。體外細胞毒性試驗具有快速、簡便和成本低的特點，是研究藥物神經(jīng)毒性的評價的主要方法。目前未見使用體外神經(jīng)細胞研究硫酸黏菌素毒性的報道，本試驗通過培養(yǎng)原代背根神經(jīng)元細胞，觀察在不同濃度的硫酸黏菌素作用下的細胞毒性效應(yīng)，以期能了解硫酸黏菌素對背根神經(jīng)細胞的毒性作用，為豐富硫酸黏菌素的毒理學(xué)資料，預(yù)防硫酸黏菌素的神經(jīng)毒性和安全使用硫酸黏菌素治療多重耐藥革蘭陰性菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 新生小鼠（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心提供）。DMEM/F12培養(yǎng)基、B－27添加劑、胎牛血清及Ⅳ型膠原酶，購自Gibco公司；硫酸黏菌素、胰蛋白酶、TritonX－100、胰島素、多聚甲醛和多聚賴氨酸（PLL），購自Sigma公司；一抗抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）多克隆抗體和即用型山羊血清封閉液，購自博士德公司；羊抗兔熒光二抗，購自北京中杉生物科技公司；β－NGF，購自Biomed公司；層粘蛋白，購自Biosciences公司；尼氏染液，購自上海微晶生物技術(shù)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配制 無血清全培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基，包含2%B－27添加劑，0.25μg/mL胰島素，10ng/mLβ－NGF。在超凈臺中，0.01%多聚賴氨酸包被96孔板，4℃過夜，無菌水洗2次，晾干。加入0.001%層粘蛋白37℃包被4h，晾干后待用。

1.3 原代背根神經(jīng)元細胞的分離培養(yǎng) 取3日齡新生小鼠，75%酒精浸泡后放入無菌平皿中，切除頭部，用剪刀沿腹部剪開，去除內(nèi)臟，翻至背側(cè)沿背部皮膚剪開，去除皮膚后從頸部椎管開口將椎管剪開，再從腹側(cè)將脊柱剪成兩部分，顯微鑷夾起一側(cè)脊柱，輕輕將脊髓挑出，暴露出椎間孔中的背根神經(jīng)節(jié)，用鑷子逐一摘取神經(jīng)節(jié)，放入4℃預(yù)冷的PBS中。修剪神經(jīng)節(jié)，去除神經(jīng)絲。PBS清洗后，剪碎神經(jīng)節(jié)，加入Ⅳ型膠原酶37℃消化1h，離心去掉膠原酶，加入0.25%胰酶37℃消化15min，F(xiàn)BS終止消化，離心去掉胰酶，加入DMEM/F12培養(yǎng)基吹打5～10次，離心去掉培養(yǎng)基加入0.25%胰酶繼續(xù)消化10 min，F(xiàn)BS終止，用無血清全培養(yǎng)基吹打成細胞懸液，細胞計數(shù)，接種到事先包被好的培養(yǎng)皿中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)24h后，大部分DRG細胞已經(jīng)貼壁，加入阿糖胞苷作用24h，換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，觀察，記錄細胞的形態(tài)和生長狀態(tài)。

1.4 原代背根神經(jīng)元細胞的鑒定

1.4.1 尼氏染色鑒定 取培養(yǎng)4d后的DRG細胞吸除培養(yǎng)液，0.01mol/L PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫下固定15min。蒸餾水洗滌2次，每次2 min。尼氏染色液37℃染色15min。蒸餾水洗滌2次，每次2s，95%乙醇約3～5s，70%乙醇洗滌2次，每次2min。顯微鏡下觀察，照相。

1.4.2 NSE熒光染色鑒定 將培養(yǎng)4d后的DRG細胞吸除培養(yǎng)液，0.01mol/L PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫下固定15min。PBS洗滌2次，每次3 min，0.2%TritonX－100透化5min，PBS洗滌2次，每次3min，羊血清封閉1h，NSE一抗（1∶200）4℃過夜，PBS洗3次，每次8min，F(xiàn)ITC標(biāo)記熒光二抗（1∶50）室溫避光作用30min。PBS洗3次，每次8 min，顯微鏡下觀察，照相。

1.5 原代背根神經(jīng)元細胞毒性測定 DRG細胞培養(yǎng)4d后，加入DMEM/F12培養(yǎng)基配制的硫酸黏菌素溶液，使細胞培養(yǎng)液中硫酸黏菌素終濃度為800 μg/mL、700μg/mL、600μg/mL、500μg/mL、400 μg/mL、300μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50 μg/mL、10μg/mL、5μg/mL和1μg/mL，每個濃度6個平行孔。同時設(shè)6孔陰性對照。37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，顯微鏡觀察染毒后細胞的形態(tài)變化，同時MTT法測定硫酸黏菌素對DRG細胞的存活率。每孔細胞加入20μL的MTT溶液（5 mg/mL，DMEM 溶解），輕輕混勻，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4h，取出，棄上清，每孔加150μL DMSO，500r/min振蕩5min，用酶標(biāo)儀在490nm下測定吸光度值（OD值），計算細胞存活率，細胞存活率＝試樣吸光度值/陰性對照吸光度值。

1.6 數(shù)據(jù)處理 根據(jù)體外細胞培養(yǎng)試驗結(jié)果，計算不同濃度硫酸黏菌素對細胞的抑制率，用SPSS 13.0軟件建立簡單線性回歸方程，計算細胞的半數(shù)抑制濃度。

2 結(jié)果

2.1 原代背根神經(jīng)元細胞的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)24 h后大部分細胞已經(jīng)貼壁，DRG細胞較大，胞體呈圓形，周圍有光暈并長出小突觸；細胞長到第3天和第4天時，胞體飽滿，細胞呈現(xiàn)明顯的多樣性，多為圓形、橢圓形和三角形，胞體體積較大，光暈明顯，突起發(fā)達，并且有許多分支，互相交織呈網(wǎng)絡(luò)狀（見中插彩版圖1）。

2.2 原代背根神經(jīng)元細胞的尼氏染色鑒定 培養(yǎng)4d的DRG神經(jīng)元進行尼氏染色后，發(fā)現(xiàn)塊狀或顆粒狀尼氏體分布在大部分神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，呈深紫色，數(shù)目較多，細胞核不著色，表明培養(yǎng)的DRG神經(jīng)元生成狀態(tài)良好（見中插彩版圖2）。

2.3 原代背根神經(jīng)元細胞的NSE熒光染色鑒定培養(yǎng)4d的DRG神經(jīng)元經(jīng)NSE免疫熒光反應(yīng)，熒光顯微鏡下可見神經(jīng)元特異性表達的蛋白NSE陽性反應(yīng)物呈明亮的綠色熒光，反應(yīng)物主要分布在胞體和神經(jīng)突起上，細胞核不著色。NSE陽性細胞，形狀為圓形，橢圓形，多邊形等，神經(jīng)細胞有較多突起，交織呈網(wǎng)狀（見中插彩版圖3）。

2.4 硫酸黏菌素對原代背根神經(jīng)元細胞形態(tài)影響由中插彩版圖4和5可見，大劑量硫酸黏菌素可致DRG神經(jīng)元細胞發(fā)生病變，表現(xiàn)為細胞固縮，聚集成團，折光性差，突起減少，胞漿空泡化，細胞大量死亡。

2.5 硫酸黏菌素對原代背根神經(jīng)元細胞存活率測定 由表1可知，當(dāng)硫酸黏菌素濃度低于10μg/mL時，對細胞存活率無明顯影響；當(dāng)硫酸黏菌素濃度達到10μg/mL時，能夠降低DRG神經(jīng)元細胞的存活率，并且隨硫酸黏菌素濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，對DRG神經(jīng)元細胞產(chǎn)生細胞毒性，抑制細胞生長；當(dāng)硫酸黏菌素濃度達到200μg/mL時；細胞存活率降到50%左右，一半細胞死亡；當(dāng)硫酸黏菌素濃度達到600μg/mL時，DRG細胞存活率降到10%左右，幾乎沒有存活的細胞。試驗結(jié)果說明，大劑量的硫酸黏菌素有很強的細胞毒性，能夠引起細胞病變和死亡。根據(jù)硫酸黏菌素對DRG神經(jīng)元細胞的抑制率，計算出硫酸黏菌素對DRG神經(jīng)元細胞的IC50為222.7μg/mL，95%可信區(qū)間為193.4～252.9μg/mL（SPSS 13.0軟件）。

表1 MTT法測定硫酸黏菌素對DRG細胞毒性

3 討論

目前對于背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元細胞的培養(yǎng)多采用懷孕14～16d胚胎大鼠［2－3］，取材方式大體分為連同脊髓同時提取的方式和逐個摘取神經(jīng)節(jié)。本試驗參照文獻報道的DRG細胞培養(yǎng)方法［4－6］并略作改進，選用新生3d的小鼠取材，并在低溫下操作，盡量保證了組織的存活。背根神經(jīng)節(jié)的獲取，采取傳統(tǒng)的取材方法，肉眼觀察下，分別打開前后椎板，用醫(yī)用眼科鑷子，逐一夾取椎間孔中的神經(jīng)節(jié)，反復(fù)練習(xí)后，該方法可熟練摘取足夠數(shù)目的神經(jīng)節(jié)，能夠滿足試驗要求。背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是一種高度分化的細胞，在發(fā)育的晚期即失去分裂增殖能力，對生存條件要求也較高，需要接種在支持物上或加入生長因子才能生長。本試驗使用多聚賴氨酸聯(lián)合層黏蛋白進行預(yù)包被培養(yǎng)DRG神經(jīng)元，同時在全培養(yǎng)基中添加了神經(jīng)生長因子β－NGF和B－27，所獲得的DRG神經(jīng)元生長狀態(tài)良好，細胞有明顯光暈，軸突發(fā)達，形成網(wǎng)絡(luò)。另外，本試驗的后期進行抗生素毒性試驗，因此在前期培養(yǎng)過程中未使用抗生素。

細胞半數(shù)抑制濃度（IC50）是指在用藥后存活的細胞數(shù)量減少一半時所需的藥物濃度。在MTT法中，就是以對照組吸光度OD值減少一半所需的藥物濃度為IC50。除此以外，半數(shù)抑制濃度的含義還相當(dāng)于藥物對培養(yǎng)細胞的最小致死劑量的平均值，作為反映藥物毒性效應(yīng)的定量指標(biāo)，在各種藥物毒性的篩選中廣泛應(yīng)用。體外方法有助于預(yù)測藥物急性暴露引發(fā)的全身和局部影響，并評估體內(nèi)毒性濃度。本試驗用新生小鼠背根神經(jīng)元建立原代細胞培養(yǎng)，測得硫酸黏菌素對DRG神經(jīng)元的IC50為222.7 μg/mL，為評估體內(nèi)毒性濃度和安全用藥提供了毒理學(xué)數(shù)據(jù)。

由試驗可知，大劑量硫酸黏菌素可致DRG神經(jīng)元細胞發(fā)生病變，使細胞內(nèi)出現(xiàn)大量空泡，引起細胞死亡，出現(xiàn)明顯的細胞毒性，而低于10μg/mL劑量組沒有明顯的細胞毒性。據(jù)文獻報道［7－8］，硫酸黏菌素對革蘭陰性細菌的最小殺菌濃度為0.5μg/mL～2μg/mL，在該濃度范圍內(nèi)，硫酸黏菌素對DRG神經(jīng)元存活率沒有明顯的影響作用。只有硫酸黏菌素濃度達到最小殺菌濃度5～20倍（10μg/mL）以上時，才對DRG神經(jīng)元存活率有一定影響。所以推測在正常殺菌濃度下單次使用硫酸黏菌素，應(yīng)該不會對神經(jīng)細胞有損傷。大劑量反復(fù)使用硫酸黏菌素時，則需要注意是否會導(dǎo)致神經(jīng)細胞的損傷和引發(fā)神經(jīng)毒性。大劑量硫酸黏菌素是如何導(dǎo)致神經(jīng)細胞損傷和死亡的機制還需進一步探討。

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