田 野，蘇丹萍，蔣 偉，鐘 望，張顯浩，陳瑞愛，，賀東生，

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣東省人畜共患病重點實驗室，廣東 廣州510642；2.廣東大華農(nóng)動物保健品股份有限公司，廣東 新興527400）

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）屬于冠狀病毒成員，為有囊膜的單股正鏈RNA病毒，以腹瀉、嘔吐、脫水和對哺乳仔豬高致死率為主要特征的一種高度接觸性腸道傳染?。?］。在1971年比利時和英國，該病毒被首次報道，之后在很多養(yǎng)豬國家都暴發(fā)了該病，特別是歐洲和亞洲。我國從1976年開始陸續(xù)有PED的報道，20世紀(jì)80年代后該病在中國流行面逐漸擴(kuò)大，并多與豬傳染性胃腸炎、輪狀病毒等其他腸道病原混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失［3］。

PEDV主要的結(jié)構(gòu)蛋白包括：纖突蛋白（S，180～220kD）、膜蛋白（M，27～32kD）、核衣殼蛋白（N，55～58kD）和小包膜蛋白（E，8.8kD）。其中PEDV的S基因長為4 150bp，由其編碼的S蛋白位于病毒粒子表面，在病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過膜融合侵入宿主細(xì)胞和在感染宿主體內(nèi)介導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的過程中都發(fā)揮重要生物學(xué)作用［4－5］。PEDV 的主要中和抗原存在于 S 基因的1 495～1 914bp之間［6］。本次試驗研究分離鑒定華南地區(qū)PEDV流行毒株并對其S基因變異進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 病料、試劑盒載體 2012年2月份，從華南地區(qū)某大型豬場采集疑似豬流行性腹瀉病料，即小腸和肛拭子。MLV、RRI、dNTPs、rTaq，購自廣州瑞真生物技術(shù)有限公司；UNIQ－5柱離心式膠回收試劑盒，購自廣州助力生物科技有限公司。

1.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)本實驗室己建立的PEDV檢測體系，合成1對針對PEDV M基因的特異性引物，Pm1：5′－TGCTTCAGTATGGCCATTACAAGTACTCTG－3′，Pm2：5′－CCTGTCGGCCCATCACAGAAGTAGT－3′，用于檢測PEDV。根據(jù)GenBank上登錄的CV777序列設(shè)計了1對針對S基因抗原表位（1 495～1 914bp）的引物，Ps1：5′－GAACTCCATTAGCGTATT－3′，Ps2：5′－CTGCAGATGTACAGACATCTA－3′，來擴(kuò)增目的片段。以上引物是采用PrimerSelect 5.0軟件設(shè)計，由Invitrogen上海生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 組織病料PEDV的RT－PCR檢測 將研磨好的組織懸液放入1.5mL離心管中，反復(fù)凍融3次，5 000r/min離心3min。用Trizol法抽提組織總RNA。根據(jù)MLV的說明，取1μL RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，之后產(chǎn)生的cDNA進(jìn)行PCR檢測。

1.4 病毒分離 將陽性病料上清液反復(fù)凍融3次，接種到Vero細(xì)胞，37℃吸附90min。棄掉毒液后加入含終濃度45μg/mL胰蛋白酶的DMEM（不含血清），培養(yǎng)96h，收毒。用同樣的方法，已傳到第20代。

1.5 PEDV S基因抗原表位序列的克隆與測序以病毒培養(yǎng)液的RNA為模板進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增。用UNIQ－5柱進(jìn)行PCR產(chǎn)物割膠回收，純化的PCR產(chǎn)物與pMD18－T載體連接，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR和酶切鑒定后，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司對陽性質(zhì)粒核苷酸進(jìn)行測序。

1.6 序列分析 利用Clustalx軟件將測序結(jié)果與國內(nèi)外其他地區(qū)的PEDV毒株的相同位置進(jìn)行多重比對，并用軟件 Molecular Evolutionary Genetics Analysis（MEGA，version 4.0）進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。同時用DNAStar中的MegAlign分析S基因抗原位點氨基酸變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEDV S抗原表位基因克隆、序列測定 應(yīng)用引物Ps1/Ps2，克隆PEDV S主要抗原表位基因，測序。通過軟件分析該段基因與國內(nèi)外其他毒株的核苷酸同源性，發(fā)現(xiàn)華南地區(qū)其他毒株如CH/GD－01/2011、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011等位于同一亞群，而與CV777、Chinju99、SM98、Br1/87等毒株的同源性較低（如圖2），處于不同的亞群。

2.2 病毒分離 病毒在接種Vero細(xì)胞前，先與含終濃度55μg/mL胰蛋白酶的DMEM作用5～10 min，然后接種到Vero細(xì)胞上，加入含終濃度45 μg/mL胰蛋白酶的DMEM維持液，96h后收取病毒液。在前5代細(xì)胞病變不明顯，隨著代數(shù)的增多細(xì)胞病變逐漸典型。連續(xù)傳代至第20代，且傳代后PCR可以檢測到病毒（如圖1）。在15代左右很明顯的觀察到合胞體樣的細(xì)胞病變，而且出現(xiàn)細(xì)胞病變的時間也從96h減少到72h。

圖1 病毒傳代后PCR檢測圖

2.3 PEDV S抗原表位基因序列的進(jìn)化分析 利用GenBank上登錄的世界各地不同分支的PEDV 55株作為參考，分析S基因抗原位點堿基的變化。其中發(fā)現(xiàn)16個堿基的變化（1509C→T，1545G→T，1575C→T，1642A→G，1677T→G，1688G→A，1695T→C，1710C→T，1761A→T，1777G→A，1782T→C，1815C→T，1833T→C，1845T→C，1894C→G，1902C→T）。

2.4 PEDV S抗原表位氨基酸的變化分析 利用DNAStar中的MegAlign對比華南地區(qū)毒株CH/GDGZ/2012 與 CV777、Chinju99、Br1/87、DR13、SM98氨基酸序列的同源性分別為97.7%、91.5%、95.4%、98.0%、94.8%。具體變化為：502aa L→S，516aa S→A，548aa T→S，593aa G→S，632aa Q→E（是分別由1 509bp C→T，1 545bpG→T，1 642bp A→G，1 777bp G→A、1 782bp T→C，1 894bp C→G）。這些說明華南地區(qū)的PEDV朝著不同的方向變異，有其地緣性。

圖2 CH/GDGZ/2012的遺傳進(jìn)化樹

3 討論

Kim S J和 Kwon H M［8－9］等指出和 PEDV 同為冠狀病毒TGEV只有1個血清型，然而對比其部分S基因發(fā)現(xiàn)不同國家地區(qū)存在多樣性。同樣的PEDV也只有1個血清型，但學(xué)者對比分析M和N基因，發(fā)現(xiàn)不同國家的PEDV呈現(xiàn)多樣性，即使同一地區(qū)PEDV也存在不同［10－11］。相對于M、N 基因，S基因是PEDV高變基因，同時也是主要的抗原基因，利用S基因?qū)Ρ刃蛄蟹治龈芊从吃摬《镜淖儺愋?。此次試驗通過對比S基因主要抗原位點（1 495～1 914bp），分析華南地區(qū)與經(jīng)典毒株的差異性。

華南地區(qū)分離到的CH/GDGZ/2012和CH/GD－01/2011、GDHSY/2011、CH/GXQZ/2011等毒株則位于G1.1.1，與經(jīng)典疫苗毒株處于不同的分支，遺傳距離較遠(yuǎn)，且其S基因主要抗原表位已經(jīng)發(fā)生較大變異，可能導(dǎo)致經(jīng)典疫苗產(chǎn)生的抗體不能對感染仔豬產(chǎn)生完全的保護(hù)，也與豬場病毒性腹瀉疫苗防疫效果不佳的現(xiàn)狀相符，可能是2010年冬季至今豬病毒性腹瀉大暴發(fā)的重要原因。值得注意的是，華南地區(qū)的PEDV毒株與泰國2008年、2011年分離毒的親緣關(guān)系很近，該病毒在兩國間及國內(nèi)如何傳播值得進(jìn)一步研究。

［1］ Pensaert M B，Debouck P.A new coronavirus－like particle associated with diarrhea in swine［J］.Arch Virol，1978，58（3）：243－247.

［2］ Kweon C H，Kwon B J，Jung T S，etal.Korean J［J］.Vet Rec，1993，33：249－254.

［3］ 倪艷秀，林繼煌，何孔旺，等.豬流行性腹瀉研究概況［J］.畜牧與獸醫(yī)，2001，33（1）：38－40.

［4］ Knipe D M，Howley P M，Griffin D E，etal.Fields Virology［M］.4th ed Philadelphia：Lippincott Williams ＆Wilkins，2001.

［5］ Kang T J，Seo J E，Kim D H，etal.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants［J］.Protein Exp Purifn，2005，41（2）：378－383.

［6］ Kang T J，Seo J E，Kim D H，etal.Protein［J］.Expr Purif，2005，41（2）：378－383.

［7］ Seong－Jun Park，Hyoung－Joon Moon，Jeong－Sun Yang，etal.Sequence analysis of the partial spike glycoprotein gene of por－cine epidemic diarrhea viruses isolated in Korea［J］.Virus Genes，2007，35：321－332.

［8］ Kim S J，Han J H，Kwon H M.Vet Microbiol，2003，94：195－206.

［9］ Kwon H M，Pi J H，Seong H W.Korean J［J］.Vet Res，1998，38：319－327.

［10］Yeo S G，Hernandez M，Krell P J，etal.Virus Genes，2003，26（3）：239－246.

［11］ Wesley R D，Woods R D，Cheung A K.J［J］.Virol，1991，65：3369－3373.

［12］Chi Y Z，Kwon H M，Jeong H K，etal.Korean J［J］.Vet Res，2003，43：219－230.