彭 興，譚岳華，黃生強(qiáng)*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2. 畜禽遺傳改良湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3. 廣西揚(yáng)翔農(nóng)牧有限責(zé)任公司，廣西 貴港 537100）

隨著人們生活水平的不斷攀升，消費(fèi)者對(duì)豬肉的品質(zhì)要求越來越高。20世紀(jì)70 年代以來，由于人們在分子數(shù)量遺傳學(xué)、分子生物學(xué)技術(shù)方面的不斷發(fā)展和完善人們發(fā)現(xiàn)盡管基因的編碼區(qū)是相對(duì)保守的序列。但在漫長的生物進(jìn)化過程中，由于環(huán)境和機(jī)體的相互作用, 不可避免地產(chǎn)生了基因編碼區(qū)和調(diào)控區(qū)種屬間的差異和種屬內(nèi)的變異，構(gòu)成了基因的多態(tài)性?；蚪MDNA 中單個(gè)堿基的顛換或轉(zhuǎn)換產(chǎn)生了單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism，簡稱SNP),從而致使基因多態(tài)性的出現(xiàn)?；虻亩鄳B(tài)性又決定了其蛋白的多態(tài)性，進(jìn)而影響基因的功能。伴著基因組學(xué)和SNP 檢測技術(shù)[1]的發(fā)展，使得現(xiàn)在對(duì)SNP 位點(diǎn)的研究達(dá)到了一個(gè)新的高度。

豬縮膽囊素受體基因[2],定位于豬八號(hào)染色體上[3]，與人類的同源性達(dá)到90%以上[4]。大量實(shí)驗(yàn)證明膽囊收縮素A 受體基因（cholecystokinin type-A r eceptor，簡稱 CCKAR）與動(dòng)物的日采食量和平均日增重有明顯的關(guān)聯(lián)[5-9]1555，Takiguchi 通過研究還發(fā)現(xiàn)CCKAR 基因能維持動(dòng)物體內(nèi)的血糖濃度[10]。本研究以杜洛克、大白、長白3 個(gè)外來品種及其雜交得到的品系杜長大(DLY)，湖南省4 個(gè)地方品種：寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源黑豬和海南地方豬五指山豬共9 個(gè)品種/群體為研究對(duì)象，采用PCR-RFLP 方法分析了CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)和+471C/G 位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性及基因頻率和基因型頻率以及該基因多態(tài)性以揭示我省不同豬群的基因多樣性。此試驗(yàn)研究目的重點(diǎn)在于利用分子遺傳學(xué)和數(shù)量遺傳學(xué)知識(shí)作為技術(shù)手段，以CCKAR 基因?yàn)槟康难芯炕颍接慍CKAR 基因不同SNP 位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性，為進(jìn)一步研究CCKAR 基因與豬肉質(zhì)性狀和生長性狀的關(guān)聯(lián)分析提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究中的試驗(yàn)豬為益陽農(nóng)科所種豬場和正虹種豬場提供，共計(jì)9 個(gè)品種/群體687 頭豬。其中地方品種包括寧鄉(xiāng)豬22 頭、桃源黑豬133 頭、大圍子豬72 頭、沙子嶺豬69 頭，海南五指山豬65 頭；外來品種含杜洛克豬94 頭、大白豬104 頭、長白豬69 頭、杜長大雜交豬59 頭。采取供試豬耳組織并提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 CCKAR 基 因+179A/G位點(diǎn)和+471C/G 位點(diǎn)基因PCRRFLP

根據(jù)GenBank DQ496228 序列設(shè)計(jì)CCKAR 基 因+179A/G 位 點(diǎn)和+471C/G 位點(diǎn)PCR，以豬基因組DNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。

+179A/G 位點(diǎn)引物F 和R 序列：

上游引物F：

CTTGGGAGACTCTGCAGTCC

下游引物R：

GGGCTGATCCAAACAGAAAA

+471C/G 位點(diǎn)引物F'和R'序列：

上游引物F'：

TGAATGGGAGCAACATCACT

下游引物R'：

CATCCTCTTGTTTCGAATCAGC

取擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn)證，對(duì)CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)和+471C/G 位點(diǎn)擴(kuò)增的目的片段進(jìn)行回收純化。然后分別利用限制性內(nèi)切酶 Hpy8I 和SatI 進(jìn)行酶切，并將酶切產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳以進(jìn)行基因型的判定。

1.2.2 CCKAR 基 因+179A/G 位點(diǎn)和+471C/G 位點(diǎn)基因統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)及+471C/G 位點(diǎn)2 個(gè)不同SNP 位點(diǎn)基因型檢出個(gè)體數(shù)，計(jì)算群體遺傳純合度、遺傳雜合度、有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量以及Hpy8I 和SatI 酶切位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率，并進(jìn)行卡方(χ2)檢驗(yàn)。

表1 不同品種CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

表2 不同品種CCKAR 基因+179A/G位點(diǎn)多態(tài)性

表3 不同品種 CCKAR 基因+471C/G 位點(diǎn)的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)

表4 不同品種CCKAR 基因+471C/G位點(diǎn)多態(tài)性

2 結(jié)果與分析

2.1 CCKAR 基 因+179A/G 和+471C/G 兩 位 點(diǎn) 的PCR 擴(kuò) 增 及RFLP 結(jié)果

2.1.1 CCKAR 基 因+179A/G 和+471C/G 兩位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測

利用PCR 技術(shù)，從豬基因組DNA擴(kuò)增得到包含CCKAR 基因+179A/G位點(diǎn)和+471C/G 位點(diǎn)2 個(gè)片段的長度分別為200 bp 和900 bp。這2 個(gè)片段經(jīng)電泳檢測與預(yù)期結(jié)果一致（見圖1 和圖2）。并對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行純化回收準(zhǔn)備用于下游實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 CCKAR 基 因+179A/G 和+471C/G 兩位點(diǎn)的RFLP 結(jié)果

對(duì)CCKAR 基 因+179A/G 位 點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Hpy8I 酶切，再通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：在CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)上存在3 種基因型 AA基因型（110 bp、90 bp）、AG 基因型（110 bp、90 bp、55 bp、55 bp）和GG基因型（90 bp、55 bp、55 bp）（見圖3）。

對(duì)CCKAR 基因+471C/G 位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶SatI 酶切，再通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：在CCKAR 基因+471C/G 位點(diǎn)上存在3 種基因型：CC基 因 型（500 bp、300 bp、100 bp）、CG基因型（500 bp、300 bp、100 bp、280 bp、220 bp）和GG基因型（300 bp、280 bp、220 bp、100bp）（見圖4）。

2.2 豬CCKAR 基因不同位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.2.1 CCKAR 基 因+179A/G 位點(diǎn)的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)和位點(diǎn)多態(tài)性

按 照 公 式p=D+H/2 與q=R+H/2，分別計(jì)算CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn) （Hpy8I 酶切位點(diǎn)）在各品種中等位基因A 和等位基因G 的頻率，并對(duì)9 個(gè)豬品種/品系樣本Hpy8I 酶切位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(見表1)。

由表1 可以看出，5 個(gè)地方品種（寧鄉(xiāng)豬、大圍子豬、沙子嶺豬、桃源豬、五指山豬）的等位基因G 的頻率均高于3 個(gè)外來品種（杜洛克豬、長白豬、大白豬）且寧鄉(xiāng)豬等位基因G 的頻率最高達(dá)到了0.818 2。從基因型的分布看，GG 型在地方品種、外來品種和杜長大雜交種中均為主要基因型，其中五指山豬GG 基因型頻率最高（0.707 7）；AA基因型在各品種中的都比較少，其中寧鄉(xiāng)豬中沒有檢測到AA 基因型，這有可能是由于樣本含量太小所致。

由表2 可以看出，CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)上所有品種的遺傳純合度均高于0.5，其中寧鄉(xiāng)豬的遺傳純合度最高（0.702 5），杜洛克豬的遺傳純合度最低（0.541 3），遺傳雜合度正好相反。從有效等位基因數(shù)上看，3 個(gè)外來品種的有效等位基因數(shù)均高于地方品種，其中杜洛克豬的最高(1.847 6)寧鄉(xiāng)豬的最低(1.423 5)；從多態(tài)信息含量上看，各個(gè)品種多態(tài)信息含量都處于0.25 到0.50 之間，說明在該位點(diǎn)上各品種具有遺傳多態(tài)性，且遺傳變異較大。

2.2.2 CCKAR 基 因+471C/G 位點(diǎn)的Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)和位點(diǎn)多態(tài)性

按照上述方法計(jì)算CCKAR 基因+471C/G 位點(diǎn) SatI 酶切位點(diǎn)上的各品種等位基因C 和等位基因G 的頻率，并對(duì)9 個(gè)豬品種/品系樣本SatI 酶切位點(diǎn)的基因型分布進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(見表3)。

由表3 可以看出，在5 個(gè)地方品種中，CC 基因型頻率均高于GG 型基因頻率；而在外來品種和杜長大雜交群當(dāng)中正好相反。在實(shí)驗(yàn)所檢測的9 個(gè)豬品種中大圍子豬CG 基因型頻率最高（0.638 9），杜洛克豬CG 基因型頻率最低（0.457 4）。從等位基因分布頻率來看，在5 個(gè)地方品種中五指山豬等位基因C 基因頻率最高（0.592 3）；在3 個(gè)外來品種中杜洛克豬G 基因頻率最高（0.633 0）；在杜長大雜交豬中，等位基因G 基因頻率為0.550 8。

從表4 不難發(fā)現(xiàn)，在CCKAR 基因+471C/G 位點(diǎn)上所有品種的遺傳純合度相差不大且均略高于0.5。其中杜洛克豬的遺傳純合度最高（0.535 4），大圍子豬的遺傳純合度最低（0.501 5）；從有效等位基因數(shù)上看，所有品種的有效等位基因數(shù)都比較高，其中大圍子豬的有效等位基因數(shù)最高(1.993 8)，杜洛克豬的有效等位基因數(shù)最低（1.867 9）；從多態(tài)信息含量上看，各個(gè)品種多態(tài)信息含量都處于0.25 到0.50 之間。

3 討論與結(jié)論

隨著這些年傳統(tǒng)表型選育持續(xù)進(jìn)行，分子育種技術(shù)也在不斷地進(jìn)步，在育種中的應(yīng)用也逐漸增加[11]。豬CCKAR 基因能夠控制動(dòng)物的進(jìn)食量、飽感以及肥胖，被認(rèn)為是豬生產(chǎn)性能的候選基因[5]。本試驗(yàn)還對(duì)2 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行了Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)所有品種都處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，說明了所采樣本來自一個(gè)孟德爾群體，采樣具有代表性。

從豬CCKAR 基因+179A/G 位點(diǎn)的遺傳分析結(jié)果可以看出：不論是在地方豬種、外來品種還是雜交品種中，等位基因G 都是優(yōu)勢基因。外來品種中G 等位基因頻率都比地方品種中G 等位基因頻率低，究其原因可能是由于地方品種相對(duì)于外來品種在進(jìn)化過程當(dāng)中保守程度不一所造成的，也有可能是由于地方品種和外來品種的不同選育方法和程度所造成。在所檢測的9 個(gè)品種中，GG 型基因型為優(yōu)勢基因型，AA基因型在各品種中分布較少，其中寧鄉(xiāng)豬中沒有檢測到AA 基因型，這可能是由于樣本采集過于集中或者含量太小所致。在除寧鄉(xiāng)豬以外的8 個(gè)豬種群體中，CCKAR 基因+179A/G Hpy8 I 酶切位點(diǎn)均存在較豐富的遺傳多態(tài)性，但多態(tài)分布程度有一定的差異，這可能與豬種的選育、豬品種在該位點(diǎn)遺傳品質(zhì)的純合性、進(jìn)化的保守性等有關(guān)。

CCKAR 基 因+471C/G 位 點(diǎn) 的遺傳分析結(jié)果表明：在基因型分布上，CG 基因型分布占所有品種的比重為56%為優(yōu)勢基因型；所有品種在該位點(diǎn)上的C、G 等位基因頻率相差不大。在地方豬種中，等位基因C 為優(yōu)勢基因；在外來品種和雜交品種中，等位基因G為優(yōu)勢基因。在地方品種中CC 基因型頻率比GG 基因型頻率高，而在外來品種中則出現(xiàn)了相反的現(xiàn)象。造成此現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橥鈦砥贩N和雜交品種是經(jīng)長期人工選育而來，人為的選擇增加了有利于提高生長速度的G 等位基因的頻率，而地方品種中由于選育程度較低，所以G 等位基因頻率相對(duì)要低。這也正符合Houston 等人的研究發(fā)現(xiàn)，+471C/G 位點(diǎn)與日采食量和平均日增重密切相關(guān)，且+471G 相對(duì)于+471C等位基因的豬具有更快的生長速度和更大的食欲[5]1561。所有品種多態(tài)信息含量都處于0.25 到0.50 之間，說明在該位點(diǎn)上各品種具有較豐富的遺傳多態(tài)性，且遺傳變異較大。該位點(diǎn)C、G 等位基因在所有地方品種和外來品種中都普遍存在，說明該位點(diǎn)的堿基取代應(yīng)該發(fā)生在品種分化之前。

本實(shí)驗(yàn)研究了9 個(gè)品種，共計(jì)687頭豬CCKAR 基因+179A/G Hpy8I酶切位點(diǎn)和+471C/G SatI 酶切位點(diǎn)的基因頻率和基因型頻率，為研究豬CCKAR 基因與豬肉質(zhì)、胴體等經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)聯(lián)分析提供了很好的材料。

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