黃國勝

PTEN是一種抑癌基因，其與腫瘤細胞的增殖、凋亡、浸潤、轉(zhuǎn)移密切相關。4EBP1和S6K1為PI3K/AKT/mTOR信號通路的下游因子。4EBP1為翻譯抑制蛋白，它能調(diào)節(jié)eIF4E的活性影響蛋白質(zhì)的翻譯［1］。S6K1具有磷酸化作用，通過磷酸化S6蛋白來調(diào)控5’TOPmRNA翻譯蛋白的起始，促進蛋白質(zhì)合成，加快細胞生長。PTEN是PI3K/AKT/mTOR信號通路中的負性調(diào)節(jié)因子，為探討抑制PTEN后對食管癌EC-1細胞4EBP1、S6K1表達的影響，本研究采用反義寡核苷酸技術利用陽離子脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于食管癌EC-1細胞，采用免疫細胞化學技術檢測4EBP1和S6K1的蛋白表達情況。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人食管癌EC-1細胞株(香港大學曹世華教授惠贈);10% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液購自四季青公司;Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自碧云天生物技術研究所;全硫代修飾PTEN ASODN(5’GTTCGTCCCTTTCCAGCTTTACA 3’)由上海生工合成;兔抗人4EBP1多克隆抗體、兔抗人S6K1多克隆抗體購自Santa Cruz公司;PV-9000二步法免疫組化檢測試劑購自中杉金橋;

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞分組培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 復蘇后的EC-1細胞在RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，待長滿培養(yǎng)瓶后以細胞數(shù)5.6×104個/孔種于6個24孔板培養(yǎng)。每板分終濃度為3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的ASODN實驗組，不進行轉(zhuǎn)染的為對照組，每組設12個復孔。培養(yǎng)24 h后按照Lipofecter脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑使用說明，在脂質(zhì)體介導下轉(zhuǎn)染終濃度為3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L 的 ASODN 分別培養(yǎng) 24、48、72 h。

1.2.2 細胞標本制備 分別撈出作用24 h、48 h、72 h的24孔板中長滿細胞的載玻片，晾干、固定、4℃保存。

1.2.3 免疫細胞化學的主要步驟 將待檢測的各組標本水化，4EBP1和S6K1抗體以1:100稀釋后按照PV-9000二步法免疫組化檢測試劑使用說明和ZLI-9031/9032/9033濃縮型DAB試劑盒使用說明進行操作。

1.2.4 對照組設計 轉(zhuǎn)染終濃度為3 μmol/L、6 μmol/L、12 μmol/L的ASODN為實驗組，不進行轉(zhuǎn)染的為對照組。

1.2.5 免疫細胞化學結果判定 免疫細胞化學:以PBS代替一抗作陰性對照;用已知的4EBP1和S6K1陽性表達的乳腺癌組織作陽性對照。4EBP1和S6K1免疫細胞化學陽性信號位于細胞漿，呈棕黃色。每張標本高倍鏡下觀察10個視野，采用十三點評分法，最終評分是兩個指標的乘積［2］。

1.3 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 10.0統(tǒng)計學分析。計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗，兩組以上均數(shù)比較用方差分析，方差不齊時先進行變量轉(zhuǎn)換，α=0.05為顯著性標準。

2 結果

PTEN ASODN對食管癌EC-1細胞4EBP1和 S6K1蛋白表達的影響見表1、2。4EBP1和S6K1的免疫細胞化學陽性信號均位于EC-1細胞的胞漿，呈棕黃色。每張標本高倍鏡下觀察10個視野，顯示轉(zhuǎn)染PTEN的ASODN于EC-1細胞后隨濃度和時間增加4EBP1蛋白表達降低而S6K1蛋白表達增強，在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與對照組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，在12μmol/L 、72 h作用最強。

表1 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細胞4EBP1蛋白的表達(±s)

表1 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細胞4EBP1蛋白的表達(±s)

注:ASODN組在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間兩兩相比以及與對照組相比P＜0.05

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表2 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細胞S6K1蛋白表達(±s)

表2 轉(zhuǎn)染PTEN ASODN于EC-1細胞S6K1蛋白表達(±s)

注:ASODN組在同一時間不同濃度和同一濃度不同時間兩兩相比以及與對照組相比P＜0.05

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3 討論

P13K/AKT/mTOR信號通路包括 PI3K、PTEN、AKT、mTOR、4EBP1、S6K1等因子，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中與多個細胞生物學環(huán)節(jié)有關，包括細胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)錄、翻譯、代謝、血管新生以及細胞周期調(diào)控等方面，并影響著腫瘤細胞的浸潤、轉(zhuǎn)移［3］，研究發(fā)現(xiàn)，PTEN基因突變、缺失和甲基化等遺傳學改變存在于許多腫瘤中，提示PTEN基因異常在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有重要作用［4］。PTEN蛋白可以逆轉(zhuǎn)PI3K所催化的反應，使PIP3去磷酸化為PIP2，降低PIP3濃度而對PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導起負調(diào)控作用。當它發(fā)生突變時PIK3/AKT通路活性增強，下游mTOR的活性也隨之增強，從而抑制4E-BP1的合成、促進S6K1的合成。PTEN ASODN使PTEN基因沉默、功能缺失而使PI3K產(chǎn)物增加、Akt組成性活化，導致mTOR信號途徑的上調(diào)，抑制4E-BP1的功能和促進了核糖體蛋白P70S6K的合成蛋白作用，導致細胞異常增殖。

［1］王曉麗，黃娟，李林，等.真核細胞翻譯起始因子eIF4E的研究進展.華西醫(yī)學，2009.24(3):787-788.

［2］何華.如何讓正確的對免疫組化結果進行半定量評分.中外健康文摘.臨床醫(yī)師，2008，5(7):162.

［3］孟艷，米蕊芳，趙春華.PI3K-AKT-mTOR信號通路在細胞分化中的作用.基礎醫(yī)學與臨床，2007，27(12):1404-1408.

［4］Dehia PL.PTEN，a unique tumor suppressor gene.Endocr Relat Cancer，2000，7(1):115-129.