陸瑤，張春云，張守響，姜文心，于紅

（青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266071）

產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs）菌株的耐藥性已經(jīng)成為當(dāng)前全球最重要的醫(yī)院耐藥問題之一［1－2］。ESBLs是由細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的能水解青霉素類、頭孢菌素類及單酰環(huán)類抗生素的一種β－內(nèi)酰胺酶，但不水解頭霉素類和碳青霉烯類抗生素，而且可以被β－內(nèi)酰胺酶抑制劑（如克拉維酸、舒巴坦）所抑制［3］。臨床上，大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌是最常見的產(chǎn)ESBLs細(xì)菌。研究結(jié)果表明，ESBLs的編碼基因多定位于細(xì)菌所攜帶的質(zhì)粒上，相對于染色體，質(zhì)粒所攜帶的耐藥基因更易于播散，因此，耐藥質(zhì)粒在產(chǎn)ESBLs菌株的多重耐藥機制中發(fā)揮著重要作用。已有研究結(jié)果顯示，質(zhì)粒圖譜在不同的地區(qū)與時間會存在一定的差異性，因此，研究細(xì)菌質(zhì)粒的攜帶情況及其與耐藥性的關(guān)系，對于控制疾病的發(fā)生、流行和治療均具有指導(dǎo)意義［4］。本實驗擬通過分析青島地區(qū)臨床分離的產(chǎn)ESBLs菌株的質(zhì)粒圖譜與耐藥表型的相關(guān)性，為進(jìn)一步深入研究ESBLs菌株質(zhì)粒與耐藥性的關(guān)系打下基礎(chǔ)，同時亦為本地區(qū)臨床抗生素的使用提供有意義的參考。

1 材料和方法

1.1 菌株

本實驗收集的51株產(chǎn)ESBLs菌，來源于2010年6月—2011年5月青島市市立醫(yī)院檢驗科分離鑒定的臨床標(biāo)本（痰液、尿液、血液及腦脊液），已去除重復(fù)標(biāo)本。所有菌株經(jīng)美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）1999年推薦紙片擴散法進(jìn)行篩選實驗，鑒定為產(chǎn)ESBLs菌，主要為大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌。

1.2 微生物敏感性試驗

采用西門子MicroScan Wal k Away 96 Pl us微生物鑒定－藥敏測試系統(tǒng)，檢測51株產(chǎn)ESBLs菌對24種常用抗生素（亞胺硫霉素、替卡西林、氨曲南、頭孢哌酮－舒巴坦、復(fù)方磺胺甲 唑、氨芐西林－舒巴坦、美羅培南、妥布霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、一代頭孢唑林、二代頭孢西丁、三代頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢泊肟、四代頭孢吡肟、阿莫西林、氨芐青霉素、哌拉西林－三唑巴坦、氧哌嗪青霉素、環(huán)丙氟哌酸、加替沙星、羅米沙星）的敏感性，參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化研究標(biāo)準(zhǔn)（2005年）進(jìn)行操作及結(jié)果判斷。

1.3 質(zhì)粒DNA的抽提

采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA［5］。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒DNA條帶

配制含有0.5 mg／L溴化乙錠的8 g／L的瓊脂糖凝膠，取5μL質(zhì)粒DNA，加上樣緩沖液1μL，在80 V／cm的電壓下電泳1.5 h，以λDNA／HindⅢ作為相對分子質(zhì)量標(biāo)記，將電泳圖譜于紫外線燈下觀察、記錄結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，采用χ2檢驗對細(xì)菌耐藥性與質(zhì)粒條帶數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1 產(chǎn)ESBLs菌株對抗菌藥物的耐藥性

本文51株菌株對一代、二代、三代頭孢藥物耐藥性最高。對氨曲南、頭孢曲松、頭孢他啶、氧哌嗪青霉素的耐藥率也較高。而對美羅培南、亞胺硫霉素、丁胺卡那霉素、頭孢哌酮－舒巴坦的耐藥率較低；對亞胺硫霉素、美羅培南、丁胺卡那霉素、哌拉西林－三唑巴坦敏感。見表1。

表1 51株產(chǎn)ESBLs菌株對抗菌藥物的耐藥情況（χ／%）

2.2 產(chǎn)ESBLs菌株質(zhì)粒電泳圖譜

電泳結(jié)果顯示，51株產(chǎn)ESBLs菌株質(zhì)粒的檢出率為62.75%，不同菌株中質(zhì)粒數(shù)目1～3條（圖1），每種質(zhì)粒圖譜中質(zhì)粒條帶分布見表2。其中，各菌株中均含有23 130 bp條帶。

圖1 產(chǎn)ESBLs菌株質(zhì)粒電泳圖譜

表2 產(chǎn)ESBLs菌株質(zhì)粒條帶分布

2.3 質(zhì)粒條帶數(shù)與細(xì)菌耐藥率的關(guān)系

菌株對氨曲南、氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松的耐藥率高于90%；對美羅培南、亞胺硫霉素、丁胺卡那霉素、頭孢哌酮－舒巴坦的耐藥率則低于20%。見表3。菌株質(zhì)粒條帶數(shù)與耐藥性無顯著相關(guān)性（P＞0.05）。

表3 細(xì)菌質(zhì)粒條帶數(shù)與耐藥率的關(guān)系（χ／%）

3 討 論

ESBLs菌株是臨床中最常見的耐藥菌株之一，由于抗生素的濫用導(dǎo)致抗生素的選擇壓力逐漸增大，部分 ESBLs菌株甚至出現(xiàn)了多重耐藥性［6－7］。目前對細(xì)菌耐藥性的研究表明，質(zhì)粒在異種菌株以及同種菌株耐藥性傳播中起關(guān)鍵作用，特別是質(zhì)粒攜帶的產(chǎn)ESBLs耐藥基因。質(zhì)粒是最早發(fā)現(xiàn)的染色體外DNA，常攜帶有多種外源基因，其編碼的性狀與細(xì)菌的選擇性優(yōu)勢和耐藥性密切相關(guān)。研究表明，ESBLs耐藥基因多定位于質(zhì)粒上，不同的復(fù)制起始點的質(zhì)粒具有相容性，導(dǎo)致細(xì)菌體內(nèi)可有多種質(zhì)粒共存?；谫|(zhì)?？赏ㄟ^轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合等方式在同種或異種細(xì)菌間傳播，其編碼的耐藥性狀亦可隨之?dāng)U散，這是產(chǎn)ESBLs菌株得以在不同地域間迅猛發(fā)展的分子機制［8］。由于各國（地區(qū)）使用抗生素的習(xí)慣不同，其ESBLs分布呈明顯的地域性分布特點。

ESBLs屬于A mbler分類的a類，按Bush分類屬2be類，是一類能夠水解青霉素、頭孢菌素類及單環(huán)β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的β－內(nèi)酰胺酶，普遍認(rèn)為是一種質(zhì)粒介導(dǎo)酶［9－10］，同時可以對磺胺類、氨基糖苷類交叉耐藥。研究表明，ESBLs的編碼基因多位于細(xì)菌所攜帶的質(zhì)粒上，而臨床野生耐藥菌株往往攜帶多種質(zhì)粒。目前，對于ESBLs編碼基因是定位于一種質(zhì)粒，還是存在于同一細(xì)菌體內(nèi)的不同質(zhì)粒之上的報道較少［11］。

質(zhì)粒圖譜本質(zhì)上是細(xì)菌內(nèi)不同相對分子質(zhì)量質(zhì)粒的瓊脂糖電泳遷移譜帶，其測定簡單、快速。通過分析細(xì)菌的質(zhì)粒圖譜，可以確定不同細(xì)菌耐藥性狀的來源以及菌株的同源性。同時，為臨床分離菌株的分子流行病學(xué)研究，指導(dǎo)臨床用藥及耐藥菌株的監(jiān)測提供線索。

質(zhì)粒圖譜在不同的地區(qū)與時間會存在一定的改變。張志堅等［12］對鄭州臨床分離的46株產(chǎn)ESBLs大腸桿菌進(jìn)行質(zhì)粒圖譜分析，結(jié)果表明，質(zhì)粒的攜帶率為100%，菌株含有1～5條質(zhì)粒條帶。本研究中菌株質(zhì)粒攜帶率為62.75%，檢出率偏低，而且質(zhì)粒譜的構(gòu)成也有一定差別，可能與質(zhì)粒的提取方法及臨床菌株的來源不同有關(guān)。

本實驗結(jié)果顯示，含不同質(zhì)粒條帶的ESBLs菌株對頭孢菌素類和青霉素類抗生素均具有普遍的耐藥性，而對碳青霉烯類、氨基糖苷類抗生素敏感，與國內(nèi)文獻(xiàn)報道的結(jié)果相似［13］，提示臨床上一旦確診為產(chǎn)ESBLs菌株感染，應(yīng)立即停用頭孢菌素類和β－內(nèi)酰胺類抗生素，而首先選用碳青霉烯類或氨基糖苷類抗生素治療。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果表明，各菌株耐藥性與質(zhì)粒條帶數(shù)無顯著相關(guān)性，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致［14］。同時研究結(jié)果顯示，產(chǎn)ESBLs菌株可攜帶1～3條質(zhì)粒，各菌株都在約7 000 bp處有一條質(zhì)粒條帶?；谫|(zhì)粒種類、數(shù)量與細(xì)菌耐藥性無相關(guān)性，提示產(chǎn)酶基因可能定位于約7 000 bp的質(zhì)粒條帶上。此外，含相同質(zhì)粒條帶數(shù)的菌株其質(zhì)粒圖譜不同，原因可能為細(xì)菌種類不同或同種細(xì)菌但非同一感染菌株發(fā)生院內(nèi)感染并在院內(nèi)各病區(qū)播散［15］。

本實驗僅對一定時間內(nèi)收集的部分產(chǎn)ESBLs耐藥菌株進(jìn)行檢測，在質(zhì)粒水平上研究了其質(zhì)粒與耐藥譜的關(guān)系，其結(jié)果僅能解釋部分菌株的耐藥性及其同源性的問題和醫(yī)院內(nèi)流行菌株的問題，以指導(dǎo)本地區(qū)醫(yī)院內(nèi)的抗生素使用，而對于耐藥基因的具體質(zhì)粒定位，還需要進(jìn)一步研究探討。同時，對于本地區(qū)耐藥菌株的流行趨勢、耐藥機制以及與其他地區(qū)的比較，均需要進(jìn)行大量長期的流行病學(xué)研究。

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