張懷斌，榮先國

(濱州醫(yī)學(xué)院(煙臺校區(qū)) 藥學(xué)院，山東 煙臺 264003)

燈盞花素(BR)又名燈盞細(xì)辛，是從中藥燈盞花中提取的黃酮類化合物，燈盞乙素是燈盞花素中的重要有效成分，屬于黃酮苷類化合物. 目前燈盞花制劑廣泛應(yīng)用于臨床，它具有擴張腦血管、增加腦血流量等作用[1]. 在研究生物大分子與藥物小分子的關(guān)系時，常以牛血清白蛋白(BSA)作為體外模型進(jìn)行研究[2]. 作者在前期研究中發(fā)現(xiàn)，BR與BSA的作用機制為靜態(tài)-動態(tài)聯(lián)合猝滅機制，但是在BR濃度小于2.16 ×10-6mol·L-1時，二者的作用機制主要表現(xiàn)為靜態(tài)猝滅機制[3]，在此基礎(chǔ)上探討了Eu3+，Cu2+，Zn2+對BR與BSA結(jié)合作用的影響[4]，研究表明：不同的金屬離子對二者結(jié)合作用影響不盡相同，因此有必要對金屬離子與二者的結(jié)合作用做進(jìn)一步探討. 鐵在生命體系中是常見的微量元素，鐵參與的生物過程對于生命而言至關(guān)重要，包括DNA的合成，呼吸作用，能量的轉(zhuǎn)換,氧的運輸?shù)萚5]. 因此作者運用熒光光譜法進(jìn)一步探討了人體內(nèi)微量元素鐵對BSA與BR作用的影響. 這對于全面了解BR在體內(nèi)的代謝,藥理和毒理作用具有重要意義.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LS-55熒光儀(America, PE company，帶有石英比色皿與攪拌磁子)，pHS-3C數(shù)字酸度計(湖北科學(xué)器材公司)，DK-S電熱恒溫水浴鍋(廣州科橋?qū)嶒灱夹g(shù)設(shè)備有限公司)，756PC紫外-可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)，XW-80A旋渦混合器(上海醫(yī)大儀器廠).

牛血清白蛋白(上海生物工程有限公司，純度>98%)，燈盞花素(昆明龍津藥業(yè)股份有限公司，批號:20100113-1)，Tris 試劑，氯化鈉，三氯化鐵，鹽酸均為分析純，溶劑為二次去離子水. 用0.1 mol·L-1pH=7.40 Tris-HCl緩沖溶液(內(nèi)含0.05 mol·L-1NaCl維持離子強度)配制濃度為1.04×10-6mol·L-1的BSA溶液；用去離子水配制濃度為1.08×10-4mol·L-1的燈盞花素水溶液. 用去離子水配制1.0×10-3mol·L-1的三氯化鐵貯備液備用.

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測試

取3 mL BSA于比色管中，依次加入不同體積的BR溶液 (加入體積<100 μL，忽略體積對濃度的影響)，設(shè)定激發(fā)波長為285 nm，發(fā)射與激發(fā)狹縫寬度比為5∶8，掃描速率為500 nm·min-1，在291K時測BSA的熒光光譜.

在上述溶液中維持Fe3+的濃度分別為3.3×10-5，3.3×10-4mol·L-1，考察Fe3+對BSA與BR結(jié)合作用的影響.

1.2.2 吸收光譜測試

取3 mL濃度為 1.08×10-4mol·L-1的BR溶液于石英比色皿中，依次加入10、20 μL 1.0×10-3mol·L-1的三氯化鐵溶液，靜置2 min后測其紫外吸收光譜，觀察BR與Fe3+的相互作用.

2 結(jié)果與討論

2.1 BR對BSA的熒光猝滅

圖1(A、B、C)分別含有0，3.3×10-5，3.3×10-4mol·L-1Fe3+時BSA與BR作用的熒光光譜圖. 由圖1可知，BSA的最大發(fā)射峰位于351 nm處，隨著BR濃度的增大，BSA的熒光強度有規(guī)律的降低，最大發(fā)射峰略有藍(lán)移，加入Fe3+前后 BSA的峰形、峰位沒有發(fā)生明顯變化，但猝滅程度增大. 當(dāng)Fe3+濃度為3.3×10-4mol·L-1時， BSA的熒光光譜發(fā)生強烈的猝滅作用，說明Fe3+與BSA有較強的作用，如圖1C所示.

1 to 6 cBR is 3.6, 7.2, 10.8, 14.4, 18.0, 21.6 (×10-7mol·L-1)圖1 Fe3+ 存在下BR對BSA熒光猝滅光譜Fig.1 Fluorescence quenching spectra of BSA with BR in the presence of Fe3+

BSA與BR混合后，BSA的熒光發(fā)生猝滅，根據(jù)前期研究[3]，BR濃度小于2.16 ×10-6mol·L-1時，其作用機制為靜態(tài)猝滅. Fe3+存在時根據(jù)Stern-Volmer方程[3-4]求出猝滅常數(shù)Ksv及猝滅速率常數(shù)Kq，見圖2和表1. 其結(jié)果遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散速率常數(shù)2.0×1010L·mol-1·s-1 [6]. Fe3+使得BSA與BR的猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)及相關(guān)系數(shù)均減小，但是在一定濃度下并未改變BSA與BR的作用機制.

表1 不含或含F(xiàn)e3+時 BR對BSA猝滅常數(shù)、猝滅速率常數(shù)及R值Table 1 Quenching constant (KSV)and quenching rate constant (Kq)with or without Fe3+

2.2 BR與BSA結(jié)合作用

圖2 Fe3+ 存在下BR與BSA作用的Stern-Volmer曲線Fig.2 The Stern-Volmer curves for the BR-BSA in the presence of Fe3+

根據(jù)lg[(F0/F)-1]=lgKa+nlg[c]求出291 K時BSA與BR的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點數(shù)n，實驗數(shù)據(jù)見圖3及表2. 由表2數(shù)據(jù)可知，加入 Fe3+后BSA與BR作用的KA及n均減小，其相關(guān)系數(shù)也相應(yīng)降低. 說明Fe3+影響了BSA與BR的結(jié)合作用.

Fe3+存在下雖未改變BSA與BR的作用機制，但使得BR對BSA的熒光猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)變小，F(xiàn)e3+濃度在3.3×10-4mol·L-1時，BSA熒光光譜發(fā)生猝滅. 結(jié)合我們前期對Fe3+與BSA作用的研究發(fā)現(xiàn)(已另文詳述)， Fe3+并未參與BSA-BR體系的協(xié)同猝滅，而是阻礙了BR與BSA的相互作用. 在pH=7.40時，BSA(等電點約為5.3)帶有較多負(fù)電荷，F(xiàn)e3+帶有正電荷，F(xiàn)e3+與BSA有較強的靜電引力，在作用過程中有競爭作用，在很大程度上限制了BR與BSA的結(jié)合. 另外BSA結(jié)構(gòu)中含有O、S、N等元素，這些元素可以與Fe3+結(jié)合形成配位結(jié)構(gòu)，占據(jù)結(jié)合位點，進(jìn)而影響B(tài)SA與BR的作用. BR為黃酮類化合物，其結(jié)構(gòu)中存在5-羥基-4-酮，4′-羥基，5,6-二羥基，因此BR與Fe3+也很有可能形成BR- Fe3+配位化合物，抑制了BR與BSA的結(jié)合. 從圖4 Fe3+與BR作用的紫外吸收光譜看，F(xiàn)e3+與BR之間存在相互作用，而且有等吸收點存在，這說明Fe3+與BR之間形成了配位復(fù)合物，阻礙了BR與BR的相互作用.

表2 Fe3+存在下BR與BSA結(jié)合的回歸方程、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及相關(guān)系數(shù)Table 2 The regression equation binding constant(KA), the number of binding site (n) and correlation coefficient (R) in the presence of Fe3+

圖3 lg[c]與lg[(F0/F)-1]的關(guān)系Fig.3 Plot of lg[c] versus lg[(F0/F)-1]

1 to 3 cFe3+ is 0.0，3.3, 6.6 (×10-6mol·L-1) respectively圖4 BR與Fe3+作用的紫外吸收光譜Fig.4 Absorption spectrum of BR with the different concentration of Fe3+

3 結(jié)論

在模擬生理條件下，采用熒光光譜、紫外吸收光譜技術(shù)探討了BR與BSA的結(jié)合作用，考察了Fe3+對二者結(jié)合作用的影響因素. Fe3+的存在使得BR與BSA作用的猝滅常數(shù)、結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)均減小. 分別從Fe3+與BSA的靜電作用、配位結(jié)合以及Fe3+與BR的配位結(jié)合三個方面分析了Fe3+對BR與BSA的結(jié)合作用的影響. 這為研究Fe3+的生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)及Fe3+存在下BR的藥代動力學(xué)作用提供了重要信息.

參考文獻(xiàn)：

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