汪淼，王敏，張培培，吳雪燕，葛慶豐，吳滿剛，于海

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇揚(yáng)州，225127)

氨肽酶(EC 3.4.11.-)是一類從多肽鏈的N端順序水解氨基酸，使氨基酸逐個(gè)游離出來的酶的總稱，根據(jù)作用的底物不同，可分為亮氨酸氨肽酶、精氨酸氨肽酶、纈氨酸氨肽酶、丙氨酸氨肽酶、苯丙氨酸氨肽酶、脯氨酸氨肽酶等［1］。氨肽酶不僅能水解多肽，還能水解大分子蛋白，產(chǎn)生小分子多肽、氨基酸及改性蛋白等，還可切除苦味肽氨端的疏水氨基酸以脫除苦味［2］，也可促進(jìn)形成降壓肽，故被廣泛用于肉制品和乳品加工中。Bolumar等［3］人探究了干式發(fā)酵香腸的成熟、風(fēng)味等與其中微生物源氨肽酶的關(guān)系，并對(duì)精氨酸氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)作了較為詳細(xì)的研究，研究表明，該氨肽酶的最適pH為7.0，最適溫度為37℃，不僅對(duì)含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基的多肽具有活力，而且對(duì)含亮氨酸、甲硫氨酸等非帶電氨基酸殘基的肽鏈及苯丙氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸殘基的肽鏈也具有一定的水解作用，特別是含上述氨基酸殘基的二肽，氨肽酶水解能力較高。Murai等［4］從日本神戶附近的Arima溫泉土壤中篩選得到1株產(chǎn)脯氨酸氨肽酶菌株Aneurmibacillus thermoaerophilus DSM10154T，該菌所產(chǎn)的脯氨酸氨肽酶可能是一種新型的能水解脯氨酰肽的氨肽酶，具有較好的熱穩(wěn)定性，并可與另一種膠原蛋白酶協(xié)同作用以降解肉制品中的膠原質(zhì)。Sato等［5］用11種蛋白酶處理酪蛋白水解液，發(fā)現(xiàn)亮氨酸氨肽酶可以脫去蛋白質(zhì)酶解液的苦味;崔春等［6］利用由氨肽酶等組成的復(fù)合酶深度酶解藍(lán)園魚參蛋白，酶解6h后蛋白質(zhì)的利用率即達(dá)到83.3%，21h時(shí)水解度達(dá)到59.7% 。

國內(nèi)外報(bào)道的產(chǎn)氨肽酶的菌株主要有毛霉、米曲霉等霉菌以及枯草芽孢桿菌、乳桿菌等，而對(duì)于葡萄球菌屬產(chǎn)氨肽酶及其酶學(xué)性質(zhì)的研究則鮮有報(bào)道。并且國內(nèi)對(duì)于微生物源氨肽酶的應(yīng)用研究主要集中在豆豉、腐乳以及乳制品方面，而對(duì)其在肉制品中的應(yīng)用研究則很少。一些葡萄球菌作為發(fā)酵劑已經(jīng)應(yīng)用于發(fā)酵里脊肉、發(fā)酵鴨肉香腸等發(fā)酵肉制品的加工工藝中［7－8］，并研究了葡萄球菌產(chǎn)脂肪酶、蛋白酶等對(duì)發(fā)酵肉制品風(fēng)味特性的影響［9］。但對(duì)與發(fā)酵肉制品良好滋味形成密切相關(guān)的氨肽酶的酶學(xué)性質(zhì)研究還不夠深入，因此本文利用從如皋火腿中分離得到的1株耐亞硝酸鹽腐生葡萄球菌RG-2，通過單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)方法等分析其產(chǎn)氨肽酶的發(fā)酵條件以及部分酶學(xué)特性，進(jìn)而為利用腐生葡萄球菌開發(fā)肉品發(fā)酵劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)RG-2，由實(shí)驗(yàn)室篩選保藏。NaNO2:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司(上海)，分析純;L-亮氨酸-對(duì)硝基苯胺(LNA)、L-精氨酸-對(duì)硝基苯胺(ANA)、苯丙氨酸-對(duì)硝基苯胺(PNA)，Sigma;對(duì)硝基苯酚(p-NP)，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵培養(yǎng)基

MSA培養(yǎng)基的配制方法參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行，亞硝酸鈉添加量(w/v，%):0.001，0.004，0.007，0.010，0.015，0.020，0.025，0.030

1.2.2 粗酶液及菌體的制備

將腐生葡萄球菌RG-2接種至MSA液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)16 h后，調(diào)菌密度至1010CFU/ml，以1%接種量接至MSA液體培養(yǎng)基(添加1.2.1所述濃度的亞硝酸鈉)中，37℃，150 r/min搖床培養(yǎng)60 h，之后取此菌液2 mL，4℃、8 000×g離心15 min，得上清液(酶液Ⅰ);上述離心后沉淀用pH 6.0的TE緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA)洗滌 2 次，棄去上清液后再次加入2 mL pH 6.0的TE緩沖液后，在37℃保溫條件下處理3 h后用超聲波細(xì)胞破碎儀冰浴破碎，破碎條件:400 W，超聲5 s間隔5 s，120次。細(xì)胞破碎液4℃、8 000×g離心10 min，得上清液(酶液Ⅱ)。

選擇LNA、ANA、PNA等幾種硝基苯胺衍生物作為反應(yīng)底物，進(jìn)行底物特異性試驗(yàn)。

1.2.3 蛋白濃度的測定

采用 Bradford 法［11］。

1.2.4 氨肽酶酶活的測定

取0.05 mL底物L(fēng)NA(16.4 mmol/L)、酶液0.1 mL、2.85 mL Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L、pH7.8)混合，在37℃下保溫60 min。用0.5 mL 30%乙酸終止反應(yīng)，在405 nm處測定吸光度，蒸餾水為對(duì)照。酶活定義:37℃時(shí)，每分鐘生成1 μmol對(duì)硝基苯胺為1個(gè)活力單位［12］。

1.2.5 菌株產(chǎn)氨肽酶發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)

在發(fā)酵劑制備以及肉制品發(fā)酵過程中，發(fā)酵劑中微生物的生長繁殖及產(chǎn)酶性能主要受亞硝酸鹽、發(fā)酵溫度、時(shí)間、鹽濃度等因素的影響。故設(shè)計(jì)在原有發(fā)酵培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，進(jìn)一步改變發(fā)酵時(shí)間、培養(yǎng)基初始pH、溫度、NaCl濃度等因素，確定菌懸液濃度及菌株產(chǎn)酶性能與各因素關(guān)系，以確定最佳發(fā)酵因素并達(dá)到為發(fā)酵肉制品發(fā)酵工藝提供參數(shù)依據(jù)的目的。

表1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表Table 1 Experiment design of single factors

固定培養(yǎng)溫度、pH、NaCl濃度3因素中的2個(gè)因素，按表1設(shè)計(jì)改變其中一個(gè)因素，以氨肽酶酶活為響應(yīng)值，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.6 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，以不同條件下的氨肽酶酶活為響應(yīng)值，選取溫度、pH、NaCl濃度為影響因素，進(jìn)行3因素3水平分析，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中5個(gè)為中心點(diǎn)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，響應(yīng)曲面試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.0軟件對(duì)響應(yīng)值進(jìn)行多元回歸分析，建立回歸方程。對(duì)回歸模型結(jié)合三維響應(yīng)面圖和等高線圖，判斷是否存在穩(wěn)定點(diǎn)，據(jù)此得出最大酶活的主效因子條件，建立優(yōu)化的催化條件并建立模型進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

發(fā)酵上清液(粗酶液)中的蛋白濃度為80 mg/L，細(xì)胞破碎液(粗酶液二)中的蛋白濃度為258 mg/L。氨肽酶酶活表示為U/mg。

2.1 亞硝酸鹽對(duì)菌株生長繁殖及產(chǎn)酶的影響

采用不同亞硝酸鹽的添加量，考察如皋火腿中功能性微生物的生長繁殖及產(chǎn)酶性能，如圖1所示。

圖1 亞硝酸鹽濃度對(duì)菌株RG-2發(fā)酵過程的影響Fig.1 The concentration of sodium nitrite on the fermentation process of S.saprophyticus RG-2

當(dāng)培養(yǎng)基中亞硝酸鹽濃度低于0.010%時(shí)，菌體密度以及產(chǎn)酶都維持在較高的水平，酶活達(dá)到18 U/mg左右;而亞硝酸鹽濃度高于0.010%時(shí)，菌體濃度降低;而當(dāng)亞硝酸鹽濃度高于0.015%時(shí)，菌株RG-2的產(chǎn)酶能力開始快速下降，當(dāng)亞硝酸鹽濃度0.020%～0.030%時(shí)，菌株產(chǎn)酶能力趨于穩(wěn)定，并達(dá)到11 U/mg左右。Bolumar等［3］利用從地中海干式發(fā)酵香腸中篩選的1株Debaryomyces hansenii CECT 12487進(jìn)行產(chǎn)氨肽酶發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明該菌株在未進(jìn)行酶純化條件下的產(chǎn)酶能力為3.0 U/mg。而Sanz等［13］通過分析自然發(fā)酵香腸中的1株功能性菌株清酒乳桿菌L.sake IATA115的產(chǎn)酶性能，得到其粗酶酶活大約為37.95U/mg。Sanz等［14］人還分析了另1株清酒乳桿菌L.sakei CECE4808，的發(fā)酵產(chǎn)酶性能，結(jié)果證明，該菌株的產(chǎn)酶能力約為2.1 U/mg。表明腐生葡萄球菌RG-2在未進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)已具有較高的產(chǎn)酶能力，并且具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽耐受性，可以應(yīng)用于火腿、發(fā)酵香腸等加工過程中以改善肉品品質(zhì)。

2.2 底物特異性

分別采用不同底物對(duì)酶液Ⅰ、酶液Ⅱ進(jìn)行水解活性測定，以驗(yàn)證該腐生葡萄球菌RG-2的底物特異性及產(chǎn)氨肽酶部位。

表2 氨肽酶的底物特異性Table 2 Substrate specificity of aminopeptidase from S.saprophyticus RG-2

由表2可知，各種底物實(shí)驗(yàn)結(jié)果的胞外酶酶活均顯著高于胞內(nèi)酶酶活，表明該類氨肽酶為胞外酶。該菌株所產(chǎn)氨肽酶對(duì)于底物L(fēng)NA的分解效果最好，達(dá)到17.415 U/mg;其次為PNA，其酶活為11.025 U/mg明顯低于底物L(fēng)NA;水解活性最弱的為ANA組。RG-2氨肽酶對(duì)不同底物的水解活性顯示出一定的差異?？偟膩砜?，該氨肽酶主要對(duì)小肽 N端疏水性氨基酸，如Leu、Phe構(gòu)成的肽鍵有較強(qiáng)的水解活性;而對(duì)小肽N端非疏水性氨基酸，如Arg構(gòu)成的肽鍵水解活性非常弱。比較底物水解活性來看，該氨肽酶對(duì) Leu-pNA(LNA)有最大的水解活性，是一種亮氨酰氨肽酶。

2.3 菌株產(chǎn)氨肽酶條件優(yōu)化

2.3.1 pH值

發(fā)酵溫度為37℃，NaCl濃度為2.5%，改變反應(yīng)體系初始pH進(jìn)行單因素試驗(yàn)，菌密度及酶活結(jié)果如圖2所示，該氨肽酶的 pH-活性曲線相對(duì)較寬，而最適生長pH范圍卻相對(duì)較窄，pH值對(duì)其生長繁殖的影響非常顯著，最適產(chǎn)酶pH較最適生長pH小。在pH4.2～4.8范圍內(nèi)，腐生葡萄球菌RG-2菌密度及所產(chǎn)氨肽酶酶活力隨pH增大略有上升，但均處于較低水平;當(dāng)pH5.4～6.0時(shí)，菌密度及酶活隨pH增大快速上升，并在pH6.0時(shí)菌體產(chǎn)酶近最適pH，而繼續(xù)提高培養(yǎng)基初始酸度至pH6.6時(shí)，菌體RG-2生長繁殖及產(chǎn)酶能力均達(dá)到最大值，氨肽酶酶活達(dá)到17.4 U/mg;當(dāng)pH大于7.2時(shí)，pH顯著抑制氨肽酶酶活，而對(duì)菌密度影響不明顯。

由此可知菌株RG-2產(chǎn)氨肽酶酶活的最佳pH為6.0～7.2，處于近中性范圍，當(dāng)pH6.6～7.2時(shí)，菌株生長繁殖及產(chǎn)酶均為最佳值。而文獻(xiàn)報(bào)道的微生物產(chǎn)氨肽酶最適 pH 大約為 6.0 ～8.0［15－18］。

圖2 pH對(duì)菌株RG-2生長及產(chǎn)氨肽酶活力的影響Fig.2 Effect of pH values on the activity of aminopeptidase and growth from the strains RG-2

2.3.2 溫度

固定發(fā)酵液的pH為7.2，NaCl濃度為2.5%，改變發(fā)酵體系的初始溫度并進(jìn)行單因素試驗(yàn)，酶活測定結(jié)果如圖3所示。菌株RG-2的最適生長溫度(45℃左右)較最適產(chǎn)酶溫度(40℃左右)高。27～37℃時(shí)，菌株RG-2產(chǎn)氨肽酶能力及酶活隨溫度升高快速增加，當(dāng)溫度近40℃時(shí)，氨肽酶酶活達(dá)到最大，而后隨溫度升高酶活迅速下降;而菌密度則在27～42℃隨溫度升高緩慢增加，45℃左右時(shí)，菌體生長繁殖達(dá)到最佳值;超過47℃，菌體生長及酶活都受到顯著抑制，可能是高溫抑制了菌體的生長繁殖導(dǎo)致菌密度較低，故產(chǎn)酶量較小，也可能高溫改變了氨肽酶結(jié)構(gòu)。綜上，該氨肽酶的最適酶活溫度為40℃左右，最大酶活為17.55 U/mg，而菌株RG-2最適生長溫度則為45℃左右。

圖3 溫度對(duì)菌株RG-2氨肽酶活力的影響Fig.3 Effect of temperature on the activity of aminopeptidase and growth from the strains RG-2

為了使微生物的生長速度最快和代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率最高，在發(fā)酵過程中必須根據(jù)菌種的特性，選擇和控制合適的溫度。多數(shù)報(bào)道的菌株產(chǎn)氨肽酶最適溫度為35～45℃［13－15］。本實(shí)驗(yàn)菌株RG-2產(chǎn)氨肽酶的最適溫度可能為40℃左右，在37～42℃范圍內(nèi)均具有較高的酶活，屬于中溫酶范疇。

2.3.3 NaCl濃度

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定發(fā)酵液初始pH 7.2，反應(yīng)溫度37℃，改變發(fā)酵體系的NaCl濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，酶活如圖4所示。當(dāng)NaCl濃度低于3%時(shí)，菌株RG-2能正常生長繁殖，并具有較高的產(chǎn)酶能力。其中當(dāng)NaCl濃度約2%時(shí)，菌體生長繁殖達(dá)到最適鹽濃度，此時(shí)菌密度為4.6×1010，酶活為17.4 U/mg，而菌株酶活在NaCl濃度約1%時(shí)最高，酶活約為20.25 U/mg;當(dāng)NaCl濃度高于3%時(shí)酶活快速下降，可能是此時(shí)環(huán)境鹽濃度雖然仍有利于菌體生長但已不適宜菌株產(chǎn)氨肽酶或高濃度鹽抑制了氨肽酶酶活;當(dāng)鹽濃度超過4%時(shí)，NaCl表現(xiàn)出對(duì)菌體生長繁殖顯著的抑制作用。

圖4 NaCl濃度對(duì)菌株RG-2氨肽酶活力的影響Fig.4 Effect of concentration of NaCl on the activity of aminopeptidase and growth from the strains RG-2

NaCl濃度對(duì)于菌體產(chǎn)酶的影響依菌種不同差異較大，因?yàn)榛鹜?、中式香腸等發(fā)酵肉制品均具有一定的鹽含量，所以研究NaCl濃度對(duì)于菌株生長繁殖及產(chǎn)酶的影響具有重要的意義。

2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

運(yùn)用Design expert8.0中的Box-Behnken進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表3所示。

表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Experiment design of Box-Behnken

2.4.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

設(shè)計(jì)Box-Behnken試驗(yàn)方案，實(shí)施試驗(yàn)，記錄試驗(yàn)結(jié)果。p=3，試驗(yàn)總次數(shù)N=17，響應(yīng)曲面法的試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

回歸系數(shù)、回歸方程的顯著性檢驗(yàn)以及擬合度檢驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可知:模型極顯著(P＜0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.534 4＞0.05)，說明該模型有較好的擬合度，可以用于腐生葡萄球菌產(chǎn)氨肽酶發(fā)酵條件的優(yōu)化。對(duì)回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，因素A和B、B和C之間的交互作用對(duì)菌株產(chǎn)氨肽酶的影響均極顯著(P＜0.05)，而其他一次項(xiàng)及二次項(xiàng)因素對(duì)菌株產(chǎn)氨肽酶的影響均極顯著(P＜0.01)。根據(jù)回歸系數(shù)，可得二次多項(xiàng)回歸方程:

Y=23.88+1.18A－2.20B+0.95C+0.99AB－2.04AC－0.72BC－1.32A2－6.07B2－5.00C2，其中R2=0.993 5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Results of fermentation conditions by Box-Behnken test design

相關(guān)系數(shù)R2=0.993 5說明該回歸模型能夠解釋99.35%的該菌株發(fā)酵產(chǎn)氨肽酶酶水平的變化，回歸擬合程度較好。因此回歸方程給菌種的發(fā)酵產(chǎn)酶提供了一個(gè)合適的模型。

2.4.2 響應(yīng)曲面分析與條件優(yōu)化

以菌株RG-2產(chǎn)氨肽酶酶活為響應(yīng)值，各因素水平均為標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)，各因素間交互作用的響應(yīng)曲面如圖5所示。

表5 方差分析表Table 5 Analysis of variance table

圖5 各因素交互影響菌株RG-2產(chǎn)氨肽酶的響應(yīng)曲面和等高線圖Fig.5 Responding surface and contour plots for the interactive effect of different factors on the activity of aminopeptidase from strain RG-2

由圖5可知，AB、AC、BC交互作用均很顯著(P＜0.05)，失擬項(xiàng)不顯著(P＞0.05)，從響應(yīng)面圖可以判斷出，最佳點(diǎn)均落在試驗(yàn)考察的區(qū)域內(nèi)。由圖5a可知，pH(A)與溫度(B)交互作用顯著(P=0.012 3＜0.001)且F值較大，因素作用效果明顯;由圖5b可知，pH(A)與NaCl濃度(C)交互作用極顯著(P=0.000 2＜0.001)且F值為3因素交互作用中最大(F=47.91)，因素相互作用效果極為明顯;由圖5c可知，溫度(B)與NaCl濃度(C)交互作用較為顯著(0.01＜P=0.044 6＜0.05)，因素作用效果相對(duì)另2組較差，但仍處于合理范圍之內(nèi);綜合以上結(jié)論并由曲面的彎曲程度和等高線可以看出，響應(yīng)值的變化相當(dāng)復(fù)雜，各個(gè)具體的試驗(yàn)因素對(duì)響應(yīng)值的影響并不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。模型優(yōu)化的產(chǎn)酶發(fā)酵條件為:pH 6.822、溫度 41.25℃、NaCl濃度為1.032%。預(yù)測值酶活為 24.279U/mg，期望值為97.8%。為操作方便，模型驗(yàn)證時(shí)試驗(yàn)條件設(shè)為pH6.8、溫度41℃、NaCl濃度為1%。結(jié)果表明，此條件下測得的氨肽酶酶活為23.85U/mg，與模型估計(jì)值24.279U/mg相比，相對(duì)誤差為0.02(＜0.05)，與預(yù)測值相比沒有顯著性差異，說明采用該響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的發(fā)酵條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，利用本試驗(yàn)建立的模型在實(shí)踐中進(jìn)行預(yù)測是可行的。

3 結(jié)語

腐生葡萄球菌RG-2具有較強(qiáng)的耐亞硝酸鹽特性，當(dāng)亞硝酸鹽濃度低于0.015%時(shí)，菌株生長繁殖及產(chǎn)酶無顯著變化，當(dāng)亞硝酸鹽濃度達(dá)到0.03%時(shí)菌濃度仍能達(dá)到空白組的60%，產(chǎn)酶能力及酶活能達(dá)到空白組的67%。單因素試驗(yàn)表明:該菌株最適生長繁殖及產(chǎn)氨肽酶pH范圍較廣(pH6.0～7.2);最適產(chǎn)酶溫度為40℃左右，而最適生長溫度則為45℃左右;當(dāng)NaCl濃度大于3.5%時(shí)，菌株RG-2的產(chǎn)酶能力及生長繁殖均受到較強(qiáng)抑制。菌株產(chǎn)氨肽酶的最佳發(fā)酵條件為:pH6.8、溫度41℃、NaCl濃度為1%。此時(shí)，菌株產(chǎn)氨肽酶能力最高，達(dá)到23.85U/mg，為預(yù)測值的98%，模型驗(yàn)證試驗(yàn)表明此模型具有較好的預(yù)測能力。

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