葛平珍，劉洋，王丹，丁苗，周才瓊

(西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院暨重慶市特色食品工程技術(shù)研究中心，重慶，400716)

機(jī)體膽固醇含量過高是動脈粥樣硬化［1］、阿爾茨海默氏?。?］等重要誘因。文獻(xiàn)報(bào)道以奶制品中分離得到的降膽固醇乳酸菌較為常見，例如，從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離得到的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)NDC 75017［3］、從克非爾(由含乳酸菌、醋酸菌、酵母的開菲爾粒發(fā)酵而成的含酒精發(fā)酵乳飲料)中分離的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)Lp09 和 Lp45［4］等。

發(fā)酵酸肉作為我國的傳統(tǒng)食品，國外未見相應(yīng)研究報(bào)道。國內(nèi)研究中［5－8］對湖南侗族傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉的微生物區(qū)系及乳酸菌進(jìn)行篩選鑒定，得到了產(chǎn)酸快且符合產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢的米酒乳桿菌。郭曉蕓等［9］報(bào)道了貴州荔波布依族水族自治縣傳統(tǒng)發(fā)酵酸肉中的優(yōu)勢菌群為芽孢桿菌、乳酸菌和酵母。本實(shí)驗(yàn)室系列研究顯示，新鮮豬肉經(jīng)自然條件下厭氧發(fā)酵成酸肉后，有大量乳酸菌生長，脂肪及膽固醇含量下降［10］，經(jīng)對發(fā)酵酸肉中降膽固醇乳酸菌進(jìn)行篩選、生理生化和分子生物學(xué)鑒定，得到1株高效降膽固醇的消化乳桿菌SR10(基因片段序列1480 bp)。本實(shí)驗(yàn)以此消化乳桿菌SR10為研究對象，對其生理特性及降膽固醇機(jī)制進(jìn)行初步研究，為發(fā)酵酸肉產(chǎn)品的功能特性和工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)，為降膽固醇乳酸菌的應(yīng)用提供原始菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

消化乳桿菌SR10(Lactobacillus alimentarius SR10)，從實(shí)驗(yàn)室自制的自然發(fā)酵酸肉中分離得到;藥敏紙片(青霉素 G 10 μg/片、新霉素 30 μg/片、四環(huán)素 30 μg/片、先鋒霉素Ⅴ30 μg/片、苯唑青霉素 1 μg/片、先鋒霉素Ⅵ30 μg/片、丁胺卡那霉素 30 μg/片、強(qiáng)力霉素 30 μg/片、氨芐青霉素 10 μg/片、頭孢呋新 30 μg/片、慶大霉素 10 μg/片、復(fù)達(dá)欣 30 μg/片、氧哌嗪青霉素100 μg/片，等);磷酸氫二鉀，檸檬酸氫二銨，葡萄糖，吐溫80，乙酸鈉，硫酸鎂，硫酸錳，無水乙醇，磷酸，均為分析純;蛋白胨，牛肉膏，酵母粉，瓊脂粉，膽鹽，等。

MRS液體培養(yǎng)基:按參考文獻(xiàn)［12］配制。MRS固體培養(yǎng)基:MRS液體培養(yǎng)基，瓊脂17 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水裝置，美國Millipore公司;SW-CJ-1FD潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;WH-1微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司;JY92－N超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝科器研究所;722可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司;Avanti J-30I座式離心機(jī)，Beckman Coulter;等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)菌株的活化

用接種環(huán)取4℃斜面保藏的消化乳桿菌SR10于5 mL已滅菌的MRS培養(yǎng)液中，37℃條件下靜置培養(yǎng)12 h進(jìn)行活化。活化3次后，得到的菌株可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的原始菌株。

1.3.2 消化乳桿菌SR10的生理特性

(1)最適溫度測定［12］:實(shí)驗(yàn)菌株 SR10按照0.3%(v/v)接種到10 mL培養(yǎng)液中，在溫度為15、20、25、30、35、40、45 ℃條件下分別培養(yǎng) 24 h，以未接種的培養(yǎng)液作對照組，在A600條件下測定其OD值。根據(jù)菌液濁度變化判斷其最適生長溫度。

(2)生長曲線和產(chǎn)酸特性［13］:消化乳桿菌SR10按0.3%(v/v)的量接種到10 mL培養(yǎng)液中，試管按時間編號分別0，2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24(h)。在測定的最適溫度和最適pH條件下培養(yǎng)，每隔2 h在A600條件下測定菌液濁度(OD)和pH值。以時間為橫坐標(biāo)、濁度(OD)和pH值為縱坐標(biāo)做圖，得到菌株生長曲線和產(chǎn)酸曲線。

(3)耐酸性［14］:調(diào)整實(shí)驗(yàn)菌株濁度(OD)在 0.8～1.0范圍內(nèi)，菌株活菌數(shù)約為107CFU/mL。按1%(v/v)接種于pH為2.0，2.5，3.0的MRS培養(yǎng)液中，30℃條件下培養(yǎng)，6 h內(nèi)，每隔2 h采用梯度稀釋法測定培養(yǎng)液中乳酸菌活菌數(shù)。平行測定3次，求平均值。以橫坐標(biāo)為時間、縱坐標(biāo)為單位菌落總數(shù)的對數(shù)值做圖，得到乳酸菌耐酸性曲線。

(4)耐膽鹽性［15］:調(diào)整實(shí)驗(yàn)菌株濁度(OD)在0.8～1.0范圍內(nèi)，菌株活菌數(shù)約為107CFU/mL。按1%(v/v)分別接種于膽鹽添加量為0.1%、0.2%、0.3%的MRS培養(yǎng)液中，30℃條件下培養(yǎng)，8 h內(nèi)，每隔2 h采用梯度稀釋法測定培養(yǎng)液中乳酸菌活菌數(shù)。平行測定3次，求平均值。以時間為橫坐標(biāo)、單位菌落總數(shù)的對數(shù)值為縱坐標(biāo)做圖，得到乳酸菌耐膽鹽曲線。

(5)抗藥敏性［16］:實(shí)驗(yàn)菌株活化后，用無菌生理鹽水將菌液稀釋到105CFU/mL，按照涂布接種法將1 mL菌液接種于MRS瓊脂平板培養(yǎng)基上，接著將3片藥敏紙片均勻放置在接種過的平板上。30℃條件下培養(yǎng)48 h，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3.3 膽固醇降低機(jī)制研究［17－18］

(1)消化乳桿菌SR10在含膽固醇的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，分別測定上清液、沉淀洗液中膽固醇含量，培養(yǎng)液中減少的膽固醇量與沉淀中膽固醇量的差值視為菌株同化的膽固醇量。通過以上方法可得到同化作用和沉淀作用消耗的膽固醇量。

加入2 mL菌液及顯色液反應(yīng)20 min后，在560 nm測定吸光度。培養(yǎng)液經(jīng)離心(12 000×g，10 min，4℃)得到沉淀，將沉淀用磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)洗滌兩遍，同樣條件離心，得到的上清液即為沉淀洗液。同化率計(jì)算公式:

式中:D為膽固醇總量;S為上清液中膽固醇含量;X為沉淀洗液中膽固醇含量。

沉淀率計(jì)算方法:

式中:D為膽固醇總量;X為沉淀洗液中膽固醇含量。

(2)篩選菌株降膽固醇能力與時間關(guān)系:以1%接種量將其接種于高膽固醇培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12 h后每隔4 h取樣測定培養(yǎng)液中上清液及沉淀洗液中的膽固醇含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化乳桿菌SR10最適溫度

SR10在不同溫度下生長曲線見圖1。SR10最適生長溫度為30℃，與大部分乳酸菌最適生長溫度一致。

圖1 SR10在不同溫度下的生長情況Fig.1 The growth of SR10 at different temperature

2.2 消化乳桿菌SR10生長曲線及產(chǎn)酸特性曲線

SR10生長曲線和產(chǎn)酸特性曲線見圖2。在MRS培養(yǎng)液中，SR10培養(yǎng)6 h左右從生長期進(jìn)入對數(shù)期，培養(yǎng)12 h左右進(jìn)入穩(wěn)定期。產(chǎn)酸速率隨著菌體生長密度增大而升高，在培養(yǎng)過程中pH值不斷降低，特別是菌體從生長期到對數(shù)期下降較為明顯，進(jìn)入穩(wěn)定期后pH略為下降，最低pH約為4.0。

圖2 SR10的生長曲線和產(chǎn)酸特性Fig.2 Growth curves and ability of producing acid of SR10

2.3 消化乳桿菌SR10耐酸性及在不同pH下生存情況

SR10耐酸性如圖3所示，在不同pH下培養(yǎng)6 h后的生存情況如圖4所示。SR10在pH 2.0、2.5、3.0條件下培養(yǎng)6 h，菌落總數(shù)有所下降，其存活率分別為38.02%、48.53%、58.47%。表明篩選菌株在高酸性環(huán)境中具有較強(qiáng)的存活力。發(fā)酵酸肉在發(fā)酵過程中產(chǎn)生酸類物質(zhì)，使乳酸菌的生長環(huán)境酸度升高，篩選菌株具有較強(qiáng)的耐酸性，能夠發(fā)揮菌株降膽固醇的活性。

圖3 SR10在不同pH下的存活力Fig.3 Survival of SR10 under different pH

圖4 篩選菌株SR10不同pH下培養(yǎng)6h的存活率Fig.4 Survival of the screened strain SR10 under different pH

一般人體胃部pH范圍在3.0～5.0之間，小腸pH在4.0～5.5之間，大腸pH大于5.0。通過對篩選菌株耐酸性實(shí)驗(yàn)表明，篩選菌株在酸性條件下具有較強(qiáng)的存活率，如果進(jìn)入腸道消化系統(tǒng)，不影響菌體生存及其降膽固醇活性，因此，該篩選菌株可作為生產(chǎn)低膽固醇食品的發(fā)酵劑或作為活菌制劑應(yīng)用。

2.4 消化乳桿菌SR10耐膽鹽情況

SR10耐膽鹽性活性如圖5。在培養(yǎng)8 h后，SR10在膽鹽添加量為0.1%、0.2%的培養(yǎng)液中基本能夠正常生長，在0.3%膽鹽添加量中培養(yǎng)8h，SR10的存活率為39.73%，其生長受到了明顯抑制。

2.5 消化乳桿菌SR10抗藥敏性

圖5 SR10在不同膽鹽下的存活特性Fig.5 Survival of SR10 under different bile salt

將SR10活化后接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基平板上，貼上不同藥敏紙片，培養(yǎng)48 h后觀察并用游標(biāo)卡尺測量不同抗生素藥品紙片抑菌圈大小，結(jié)果見表1。

表1 SR10對不同抗生素敏感性結(jié)果Table 1 sensitivity to different kinds of antibiotics of SR1

消化乳桿菌SR10對氨芐青霉素、美滿霉素、麥迪霉素和青霉素G的抑菌圈直徑都在35 mm以上，最大為美滿霉素達(dá)38 mm，抑菌圈直徑在35～25 mm之間的是四環(huán)素、羧芐青霉素、氯霉素、氧哌嗪青霉素和強(qiáng)力霉素。抑菌圈直徑在25 mm以下的是頭孢呋新、頭孢唑林(先鋒V)、頭孢氨芐(先鋒IV)、頭孢拉定(先鋒VI)、新霉素、丁胺卡那霉素、苯唑青霉素、復(fù)達(dá)欣、卡那霉素和慶大霉素。其中卡那霉素抑菌圈直徑最小為7.44 mm。綜合考慮紙片的抗生素含量與抑菌圈大小，消化乳桿菌SR10對青霉素G和氨芐青霉素的敏感性較強(qiáng)。大部分抗生素對篩選菌株SR10的生長都有不同程度的影響。所以在酸肉發(fā)酵過程中注意避免抗生素對肉制品中乳酸菌的干擾。

2.6 消化乳桿菌SR10降膽固醇作用

消化乳桿菌SR10降膽固醇能力與時間關(guān)系及其分析如圖6。隨培養(yǎng)時間延長，SR10沉淀降膽固醇率、同化降膽固醇率均逐漸升高，在培養(yǎng)過程中，膽固醇沉淀率從9.42%增加到12.8%，且同化膽固醇率從14.98%增加到20.89%。表明消化乳桿菌SR10生長過程中同時伴隨膽固醇的同化作用和沉淀作用，且同化作用較沉淀作用降膽固醇更明顯，菌體培養(yǎng)24 h后總降膽固醇率達(dá)到33.7%。

圖6 不同時間段SR10菌株降膽固醇情況Fig.6 Cholesterol removal of SR10 strain at different period of time

3 討論與結(jié)論

3.1 消化乳桿菌SR10的生理特性

消化乳桿菌SR10耐酸和耐膽鹽，與Pan等［19］從馬奶酒中分離得到的發(fā)酵乳桿菌特性一致。消化乳桿菌SR10與郭翔［20］從泡菜、腌制苜蓿、天然酸奶中分離得到的Lactobacillus plantarum GUO最適生長溫相同;在抑菌實(shí)驗(yàn)中，消化乳桿菌SR10的氨芐青霉素、美滿霉素，麥迪霉素，青霉素G抑菌圈較大，抑制消化乳桿菌SR10生長的作用較強(qiáng)，后者則對紅霉素和氯霉素高度敏感。Lavanya等［21］從發(fā)酵牛奶中分離得到45株乳酸菌，約20%的菌株對卡那霉素和鏈霉素有抗性，70%的菌株對福利平有抗性，僅6%的菌株對桿菌肽有抗性。

消化乳桿菌SR10與其他研究中篩選得到的乳酸菌對某些抗生素敏感，但不同菌株對不同種類的抗生素敏感程度不同。發(fā)酵原料中的抗生素可能對發(fā)酵乳酸菌的生長有抑制作用，從而影響發(fā)酵原料的利用率和發(fā)酵產(chǎn)品的質(zhì)量。

消化乳桿菌SR10的膽鹽耐受力與膽鹽水解酶的活性有關(guān)，膽鹽水解酶能水解結(jié)合型膽鹽成游離型膽鹽，使膽固醇含量降低。消化乳桿菌 SR10在0.1%、0.2%的膽鹽中均能正常生長，0.3%膽鹽則抑制其生長。而大多數(shù)益生乳酸菌在含0.5%膽鹽的PBS緩沖液中溫育4 h后對膽鹽還有抗性，只是乳酸菌總數(shù)有細(xì)微的降低［22］。

3.2 消化乳桿菌SR10降膽固醇作用

消化乳桿菌SR10對膽固醇的同化作用和沉淀作用在其生長過程中同時存在，且同化作用較沉淀作用降膽固醇更加明顯。Gilliland等［23］提出了降膽固醇的同化理論，但Grill等［24］又提出了與同化理論相對的沉淀理論。基于不同研究結(jié)果得出的不同理論及其他的研究，人們更傾向于認(rèn)為菌體降膽固醇作用是同化和沉淀共同作用的結(jié)果，但在不同的情況下，以其中的一種作用方式為主。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了酸肉中篩選的消化乳桿菌SR10的降膽固醇作用，結(jié)果表明，菌株的生長過程中伴隨降膽固醇作用，且同化和沉淀作用同時存在，在整個過程中同化作用起主要作用。

［1］Maxfield，F(xiàn)rederick R，Tabas I.Role of cholesterol and lipid organization in disease［J］.ature，2005，438(7 068):612－621.

［2］Wolozin B.Cholesterol and the Biology of Alzheimer’s Disease［J］.Neuron，2004，41(1):7－10.

［3］王今雨，滿朝新，楊相宜，等.植物乳桿菌NDC 75017的降膽固醇作用［J］.食品科學(xué)，2013，34(3):243－247.

［4］Huang Ying，Wang Xiao-jun，Wang Jin-feng，et al.Lactobacillus plantarum strains as potential probiotic cultures with cholesterol-lowering activity［J］.J Dairy Sci，96(5):2 746－2 753.

［5］李宗軍，李羅明.侗族傳統(tǒng)發(fā)酵肉的微生物特性［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2002，14(1):19－22.

［6］李宗軍，江漢湖.中國傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過程中微生物的消長變化［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2004，31(4):9－13.

［7］章德法，徐為民，徐幸蓮.侗族發(fā)酵酸肉中乳酸菌的篩選及鑒定［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，24(6):986－988.

［8］車科，麻成金，黃群，等.湘西傳統(tǒng)酸肉乳酸菌分離、篩選及鑒定［J］.中國釀造，2008(6):25－28.

［9］郭曉蕓，龍江，張亮，等.貴州荔波傳統(tǒng)酸肉微生物菌群與營養(yǎng)品質(zhì)評價［J］.中國釀造，2009(7):69－72.

［10］周才瓊，李艷芳，杜木英.酸肉發(fā)酵過程中脂肪降解及影響因素的研究［J］.食品工業(yè)科技，2009，30(4):171－173，177.

［11］李平蘭，賀稚非.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)原理與技術(shù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2005:264－267.

［12］郝林.食品微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2001:92－93.

［13］姜華.降膽固醇功能乳酸菌的篩選及其特性的研究［D］.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010:24－25.

［14］汪曉輝，于平，勵建榮.泡菜、傳統(tǒng)臘腸中降膽固醇乳酸菌的篩選及鑒定［J］.微生物學(xué)報(bào)，2009，49(11):1438－1444.

［15］田建軍.高效降膽固醇乳酸菌的篩選及其在發(fā)酵乳中的應(yīng)用［D］.呼和浩特:內(nèi)蒙古大學(xué)，2006:20.

［16］張德珍，潘道東，戴傳超.一株降膽固醇乳酸菌的鑒定及其在模擬胃腸環(huán)境中抗性的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(11):281－284.

［17］張佳程，駱承庠.乳酸菌對食品中膽固醇脫除作用的研究［J］.食品科學(xué)，1998，19(3):20－22.

［18］Guillermo K，Pablo P，Graciela D A.Screening of bile resistance and bile precipitation in lactic acid bacteria and Bifidobaceria［J］.J.Food Protection，1999，62:905－912.

［19］Pan Dao-dong，Zeng Xiao-qun，Yan Yu-ting.Characterisation of Lactobacillus fermentum SM-7 isolated from koumiss，a potential probiotic bacterium with cholesterol-lowering effects［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2011，91(3):512－518.

［20］郭翔.降膽固醇益生菌篩選及其功能機(jī)理的研究［D］.無錫:江南大學(xué)，2009:13－25.

［21］Lavanya B，Sowmiya S，Balaji S，et al.Screening and characterization of lactic acid bacteria from fermented milk［J］.British Journal of Dairy Sciences，2011，2(1):5－10.

［22］Argyri A A，Zoumpopoulou G，Karatzas K A G，et al.Selection of potential probiotic lactic acid bacteria from fermented olives by in vitro tests［J］.Food Microbiology，2013，33(2):282－291.

［23］Gilland S E，Nelson C R，Maxwell C.Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus［J］.Applied Environmental Microbiology，1985，49(2):377－381.

［25］Grill J P，Cayuela C，Antoine J M，et al.Effects of Lactobacillus amylovorus and Bifidobacterium breve on cholesterol［J］.Letters Application Microbiology，1990，31:154－156.